《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》：Spatial and functional characterization of ER stress proteins links fibroblast plasticity and proliferative processes in human osteoarthritic synovitis
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内质网（ER）应激与滑膜炎之间存在强烈的相互作用。除了其在蛋白质折叠中的经典作用外，ER应激分子伴侣在病理条件下可能促进炎症、细胞存活和成纤维细胞活化。本研究旨在定位并定量人类发炎滑膜中的11种ER应激蛋白（BiP、HYOU1、MANF、PDIA4、GANAB
内质网（ER）应激与滑膜炎之间存在强烈的相互作用。除了其在蛋白质折叠中的经典作用外，ER应激分子伴侣在病理条件下可能促进炎症、细胞存活和成纤维细胞活化。本研究旨在定位并定量人类发炎滑膜中的11种ER应激蛋白（BiP、HYOU1、MANF、PDIA4、GANAB、HSP90B1、TXNDC5、DNAJB11、LMAN1、ERP29、CALR），并研究它们在ER应激、促炎或促纤维化刺激下在成纤维细胞样滑膜细胞（FLS）中的表达。通过免疫组织化学，研究人员对来自骨关节炎（OA）、慢性焦磷酸盐关节病（CPPA）和类风湿关节炎（RA）患者的第一队列福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）活检样本进行分析，发现这些ER分子伴侣在低度炎症（Tak <4）中主要定位于衬里层，并在高度炎症条件下（Tak ≥4）扩展至衬里下层，在RA中呈广泛分布。应用于第二队列来自OA和RA诊断患者的FFPE组织样本的成像质谱流式细胞术揭示了ER应激蛋白与CD55+ FLS在衬里层中的共表达，以及它们在炎症过程中随着CD34+CD31- FLS逐渐浸润到衬里下层。这些观察结果在更大规模的OA患者队列中通过免疫荧光得到证实。随着炎症进展，衬里层中与CD55的共表达丧失，同时衬里下层中与CD34的共表达逐渐转变。在体外，ER应激蛋白，特别是BiP、HYOU1、MANF、PDIA4、HSP90B1、LMAN1、CALR和DNAJB11，在人类OA FLS中在ER应激、促炎或促纤维化刺激后过表达，其中BiP、PDIA4、HSP90B1、ERP29和CALR也被分泌。PDIA4成为核心角色：其缺失显著损害FLS增殖和迁移，突显其在驱动滑膜炎中的直接作用。本研究首次提供了人类关节炎滑膜中ER分子伴侣的空间和功能特征，将ER应激与成纤维细胞可塑性、炎症和纤维化联系起来。
本论文解读基于发表在《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》上的研究。滑膜是关节的结缔组织，由衬里层（lining）和衬里下层（sublining）构成，其稳态依赖于成纤维细胞样滑膜细胞（FLS）和巨噬细胞样滑膜细胞（MLS）。滑膜炎（synovitis）以FLS增殖、衬里层增生、免疫细胞浸润、新生血管形成和纤维化为特征，在骨关节炎（OA）和类风湿关节炎（RA）中均存在，但RA中更为显著。内质网（ER）应激通过未折叠蛋白反应（UPR）维持蛋白质稳态，但持续应激可促进炎症和成纤维细胞活化。先前研究表明，ER应激蛋白与滑膜炎的组织学炎症评分（HIS）高度相关，但其空间分布和功能角色尚不明确。因此，研究人员旨在通过空间定位和功能分析，阐明ER应激蛋白在人类滑膜炎中的表达模式及其对FLS表型可塑性的影响，重点关注FLS亚群（CD55
+衬里层FLS和CD34
+CD31
-衬里下层FLS）。
研究人员开展的研究包括：对来自第一队列（CHU Liège，n=24）的OA、慢性焦磷酸盐关节病（CPPA）和RA患者的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）滑膜活检样本进行免疫组织化学（IHC）分析，定位和半定量11种ER应激蛋白；对第二队列（UCLouvain，n=3）的OA和RA患者FFPE组织进行成像质谱流式细胞术（IMC），实现多重空间蛋白图谱；对第三队列（CHU Liège，n=25）的OA患者进行免疫荧光（IF）验证；并利用原代OA FLS，通过Western blot、siRNA沉默、BrdU增殖实验和实时迁移实验（IncuCyte系统）研究ER应激蛋白在体外对FLS增殖和迁移的影响。结论表明，ER应激蛋白在低度炎症时主要位于衬里层，高度炎症时扩展至衬里下层，并与CD55
+ FLS和CD34
+CD31
- FLS的动态共表达模式相关，其中PDIA4通过促进FLS增殖和迁移直接驱动滑膜炎。该研究首次提供了人类关节炎滑膜中ER分子伴侣的空间和功能特征，将ER应激与成纤维细胞可塑性、炎症和纤维化联系起来。
主要关键技术方法包括：免疫组织化学（IHC）用于第一队列（24例OA、CPPA、RA患者）的蛋白定位和半定量分析；成像质谱流式细胞术（IMC）用于第二队列（3例OA和RA患者）的多重空间蛋白检测；免疫荧光（IF）用于第三队列（25例OA患者）的共表达验证；以及体外细胞实验，包括原代FLS分离、siRNA转染、Western blot、BrdU增殖实验和实时迁移实验，以研究蛋白功能。此外，胶原酶诱导的滑膜炎（CIS）小鼠模型用于体内验证。
研究结果如下：
**ER应激蛋白在发炎的人类和小鼠滑膜中的定位和定量**：通过IHC，在人类滑膜中，11种ER应激蛋白（BiP、HYOU1、MANF、PDIA4、GANAB、HSP90B1、TXNDC5、DNAJB11、LMAN1、ERP29、CALR）在低度炎症（Tak <4）时主要局限于衬里层，而在高度炎症（Tak ≥4）时扩展到衬里下层，RA中呈广泛分布。MANF、PDIA4、GANAB、TXNDC5、CALR在RA中显著过表达。在CIS小鼠模型中，MANF、PDIA4、HSP90B1、DNAJB11、LMAN1、CALR在发炎滑膜中表达增加，并与炎症和纤维化标志物相关。
**在人类发炎滑膜中靶向定位相关滑膜细胞**：通过IMC，识别出CD55
+（衬里层FLS）、CD34
+CD31
-（衬里下层FLS）和CD68
+（MLS）为关键细胞亚群。CD55在OA衬里层强表达，RA中消失；CD34在炎症OA衬里下层增加，RA中广泛分布；CD68类似CD55但保留在RA中。淋巴细胞（CD3
+、CD4
+、CD20
+）主要局限于淋巴样浸润灶。
**ER应激蛋白与成纤维细胞样滑膜细胞的共表达**：通过IMC，以PDIA4为代表，在非炎症（NIN）OA中，ER应激蛋白与CD55
+ FLS和CD68
+ MLS共表达于衬里层；在炎症（IN）OA中，它们与CD34
+CD31
- FLS共表达于衬里下层；RA中，这些蛋白广泛分布并与CD34
+CD31
- FLS共表达。监督聚类分析证实了这种区域特异性共表达模式。
**通过免疫荧光在更大OA队列中确认ER应激蛋白与FLS的共表达**：对25例OA患者进行IF分析，定量显示随着Tak评分增加，衬里层中CD55
+PDIA4
+细胞比例下降（从30%降至20%），而衬里下层中CD34
+CD31
-PDIA4
+细胞比例显著上升（从9%增至31%）。CD68
+PDIA4
+细胞比例在衬里下层也有增加。发现存在CD55
+CD34
+CD31
-中间群体，且CD55
+PDIA4
+细胞（衬里层）与CD34
+CD31
-PDIA4
+细胞（衬里下层）呈负相关（Spearman r=-0.43，p=0.03），提示PDIA4可能参与FLS表型转变。
**ER应激、炎症和促纤维化条件通过差异UPR通路调控OA FLS中分子伴侣的表达和分泌**：体外实验显示，在ER应激诱导剂（Tunicamycin，Tm）、促炎因子（TNF-α）或促纤维化因子（TGF-β）刺激下，BiP、HYOU1、MANF、PDIA4、HSP90B1、LMAN1、CALR、DNAJB11等在OA FLS中过表达，其中BiP、PDIA4、HSP90B1、ERP29、CALR在持续ER应激下被分泌。通过UPR通路（IRE1α、PERK、ATF6）抑制剂发现，HYOU1受IRE1α和ATF6调控，PDIA4受ATF6调控；IRE1α和PERK抑制降低α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）表达，提示这些通路参与成纤维细胞-肌成纤维细胞转化（FMT）。
**PDIA4通过TGF-β信号驱动OA FLS的增殖和迁移**：通过siRNA沉默HYOU1、MANF、PDIA4、DNAJB11、CALR后，在TGF-β刺激下，仅PDIA4沉默显著降低FLS增殖（BrdU实验）和迁移（IncuCyte实时划痕实验），且不影响细胞活力。IMC显示PDIA4与增殖标志物Ki67共表达，在IN OA中于衬里下层共表达，进一步支持其促增殖作用。
总结讨论：研究结论部分翻译如下：总之，在轻度炎症条件下，分子伴侣在滑膜衬里层中被检测到。随着炎症加剧和衬里层结构破坏，这些ER应激蛋白在衬里下层细胞中表达水平升高。这些蛋白由衬里层的CD55
+ FLS和CD68
+ MLS（在NIN OA中）以及衬里下层的CD34
+CD31
- FLS（在IN OA中）表达，并可能与其表型向深层滑膜转换相关。体外FLS实验进一步表明，PDIA4可能积极参与增殖和迁移过程，促进滑膜炎和OA疾病进展，但其在滑膜炎进展中的体内作用仍有待确定。本研究首次提供了滑膜炎中ER应激蛋白的空间和功能特征，将ER应激与成纤维细胞可塑性联系起来，并揭示了分子伴侣与OA滑膜炎中增殖、迁移和促纤维化过程的关联。尽管仅限于OA来源的FLS，类似的ER应激驱动机制也可能发生在RA和其他炎症性关节病中。
