单核转录组学揭示细胞类型差异下的大脑对聚乙烯纳米塑料与丁基苯甲酸苄酯同时暴露的反应

《Journal of Hazardous Materials》：Single-Nucleus Transcriptomics Reveals Cell-Type-Resolved Brain Responses to Concurrent Exposure to Polyethylene Nanoplastics and Butyl Benzyl Phthalate

　　

摘要

塑料衍生颗粒与塑料相关化学物质的共存是一种新兴的毒理学问题，但二者共同产生的神经毒性目前仍缺乏充分了解。本研究旨在探讨反复同时口服聚乙烯纳米塑料和丁基苯甲酸酯是否会加剧神经毒性，并分析相应的细胞类型特异性脑部反应。在HT-22神经元细胞中，浓度-反应矩阵分析显示聚乙烯纳米塑料与丁基苯甲酸酯之间存在正向相互作用。随后，我们在小鼠中建立了为期90天的口服暴露模型，使用纯度为50纳米的聚乙烯纳米塑料、丁基苯甲酸酯及其混合物进行实验。与单独暴露相比，同时暴露更显著地损害了动物的运动/探索行为及空间学习能力，同时还导致海马区神经元和突触损伤加重、神经递质紊乱、胶质细胞反应增强以及紧密连接相关标志物减少。通过对对照组和同时暴露组进行全脑单核RNA测序，我们发现了神经元、胶质细胞和内皮细胞群体中的转录变化，这些变化涉及突触结构、线粒体能量代谢、胶质/补体反应以及神经血管屏障相关功能。细胞间通讯分析进一步表明，在同时暴露条件下，神经元粘附/营养信号网络以及血管相关信号网络会出现收缩。针对所有四组暴露样本的靶向qRT-PCR验证结果支持了snRNA-seq分析得出的关键基因变化，包括、、、、和基因表达下降，而和基因表达上升，其中、和在聚乙烯纳米塑料与丁基苯甲酸酯的共同作用下存在显著交互作用。总体而言，这些研究结果表明，同时暴露于聚乙烯纳米塑料和丁基苯甲酸酯会加剧神经毒性，同时也强调了在神经毒性评估中需要考虑多种塑料衍生污染物的共同影响。

引言

塑料衍生颗粒与塑料相关化学物质越来越被视为具有共同毒理学意义的新兴污染物。聚乙烯纳米塑料尤其值得关注，因为聚乙烯是最为广泛生产的聚合物之一，而其在环境中的风化作用会生成二次微塑料和纳米塑料[12]。人类可通过摄入受污染的食物、饮用水、食品接触材料以及灰尘而接触到塑料颗粒[17]、[30]、[44]、[45]、[46]。丁基苯甲酸酯是一种广泛使用的邻苯二甲酸酯类增塑剂，经常在室内灰尘及其他可能与人体接触的微环境中被检测到[1]、[14]、[17]、[5]。室内灰尘可通过手口接触、将物品放入口中、直接吸入灰尘、灰尘沉积在食物表面以及吞咽从呼吸道排出的颗粒等方式导致人体口腔暴露[38]、[39]。由聚乙烯构成的微塑料/纳米塑料也可能通过饮用水、食物、食品接触材料以及灰尘进入人体[15]、[36]。这些共同的摄入途径为塑料衍生颗粒与丁基苯甲酸酯的同时暴露提供了可能性。

神经系统是塑料衍生污染物容易影响的敏感靶标。在实验模型中，微塑料和纳米塑料已被证实会导致血脑屏障功能受损、在脑组织中积累、小胶质细胞活化、神经炎症、神经传导异常以及行为功能障碍[27]、[31]、[4]、[41]、[42]。同类地，多项系统评价、元分析以及近期的人体队列研究也表明，邻苯二甲酸酯类物质会干扰神经发育、损害认知功能并引发神经行为异常[10]、[18]、[26]、[3]、[8]。越来越多的证据表明，塑料颗粒与塑料相关化学物质都可能独立扰乱神经系统的稳态，但它们在同时暴露条件下的共同神经毒性机制仍需进一步研究。尤其是，目前尚不清楚反复同时暴露于塑料衍生颗粒与塑料相关化学物质是否比单独暴露会产生更严重的神经毒性效应。此外，这种共同神经毒性背后的多细胞分子机制也尚未被充分阐明。

通过细胞类型特异性分析，可以明确多种污染物是如何影响脑部微环境的。大脑是一个高度异质的器官，由具有不同空间结构、功能及脆弱性的多种神经元和非神经元细胞组成（Siletti等人；[43]）。传统的毒理学评估和整体转录组学分析虽能表明存在神经毒性，但却无法区分暴露引起的信号变化是由于细胞组成改变、特定细胞类型的转录异常，还是两者共同作用的结果[21]、[7]、[9]。相比之下，单核RNA测序技术能够对复杂的神经组织进行高分辨率分析，已成为识别易感细胞群体、特定的转录程序以及与毒素暴露相关的细胞间通讯变化的重要工具[20]、[21]、[7]、[9]。该技术有助于从细胞类型层面解析多细胞层面的毒理学反应，从而更深入地理解多种污染物如何破坏神经系统。

在本研究中，我们探讨了反复同时口服聚乙烯纳米塑料和丁基苯甲酸酯是否会在小鼠体内加剧神经毒性，并分析了相应的细胞类型特异性脑部反应。首先，我们以HT-22海马区神经元细胞作为对照模型，建立了浓度-反应关系，明确了这两种物质在神经元层面的相互作用模式。随后，我们建立了为期90天的口服暴露模型，设置对照组、聚乙烯纳米塑料组、丁基苯甲酸酯组以及二者混合暴露组，比较不同暴露方式下的神经毒性差异，并分析选定指标上聚乙烯纳米塑料与丁基苯甲酸酯的交互作用。此外，我们还通过全脑单核RNA测序技术，分析了同时暴露于这两种物质时各细胞类型的分子状态变化，重点关注神经元、胶质细胞、内皮细胞以及细胞间通讯方面的变化。本研究旨在明确聚乙烯纳米塑料与丁基苯甲酸酯同时暴露的神经毒性机制，同时识别与这种共同暴露状态相关的神经元、胶质细胞、内皮细胞以及通讯功能的变化模块。

章节节选

化学品与试剂

聚乙烯纳米塑料（PE-NPs，标称直径为50纳米）购自中国上海的上海润宏塑料原料有限公司。丁基苯甲酸酯（BBP，纯度≥98%）和尼罗红则购自中国上海的阿拉丁试剂有限公司。CCK-8细胞增殖与细胞毒性检测试剂盒购自中国大连的大连美伦生物技术有限公司。用于检测乙酰胆碱、乙酰胆碱酯酶和多巴胺的ELISA试剂盒则来自

聚乙烯纳米塑料与丁基苯甲酸酯同时暴露会降低HT-22细胞的存活率，并呈现正向相互作用

为初步判断聚乙烯纳米塑料与丁基苯甲酸酯在神经元细胞中是否会产生协同效应，我们首先分别研究了这两种物质对HT-22细胞存活率的影响。单独使用聚乙烯纳米塑料时，其细胞存活率会随浓度升高而下降，在50–500毫克/升的浓度范围内出现显著下降（见图1A）。单独使用丁基苯甲酸酯时也表现出类似的浓度依赖性抑制作用，在10至100毫克/升的浓度范围内即可观察到显著存活率下降（见图1B）。在所选择的暴露条件下，聚乙烯纳米塑料与丁基苯甲酸酯共同作用时

讨论

本研究指出，同时暴露于聚乙烯纳米塑料与丁基苯甲酸酯属于一种混合塑料衍生污染物暴露情况，其引发的神经毒性效应比单独暴露于任一污染物更为严重。先前的研究已经证实，微塑料/纳米塑料可通过进入大脑、破坏血脑屏障、引发神经炎症、干扰神经递质功能以及导致行为障碍等方式影响大脑功能[31]、[4]、[41]、[42]。邻苯二甲酸酯类物质也被认为会干扰神经发育，

结论

本研究通过将加重的神经行为损伤与海马区神经元损伤、突触功能障碍、胶质细胞活化、血脑屏障功能改变以及细胞类型特异性的分子结构变化联系起来，进一步推动了关于多种塑料衍生污染物毒性的研究。核心研究发现是，同时暴露于聚乙烯纳米塑料与丁基苯甲酸酯会扰乱作为一个整体多细胞系统的大脑功能，神经元、胶质细胞、内皮细胞以及细胞间通讯功能都会受到影响，最终导致神经血管功能异常

环境意义

塑料衍生颗粒与塑料相关化学物质通常具有相似的摄入暴露途径，这为二者同时暴露提供了现实可能性。在本研究中，与单独暴露相比，反复同时口服聚乙烯纳米塑料和丁基苯甲酸酯会进一步加重小鼠的神经行为障碍、海马区损伤、胶质细胞活化以及血脑屏障功能异常。全脑单核RNA转录组学分析则有助于揭示这种共同暴露状态下的脑部特征

未引用参考文献

[6]、[33]

资金支持

本研究得到了吉林省科学技术发展计划项目的资助（项目编号：20260206020ZP）。

CRediT作者贡献说明

任浩道：研究工作执行、数据整理。 卢一通：论文初稿撰写、研究工作执行。 吕忠婷：研究工作执行、数据整理。 张杰：论文审阅与编辑、研究构思。 张铁华：项目管理工作协调。 任丽：论文审阅与编辑、研究构思。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。

致谢

我们衷心感谢北京吉因加科技有限公司在单核RNA测序技术方面给予我们的帮助。

卢一通|任浩道|吕忠婷|张铁华|张杰|任丽

中国长春市吉林大学食品科学与工程学院，邮编130062