《Journal of Hazardous Materials》：Metabolomics and structural modeling reveal the mechanism of broad-spectrum phthalate degradation by an enriched microbial consortium
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摘要邻苯二甲酸二丁酯（DBP）的污染会带来严重的生态风险，因此需要有效的绿色修复策略。本研究构建了一个强大的微生物群落（DBP-Micro-con），并运用多组学整合方法系统阐明了其降解机制。群落分析表明，经过富集培养后，优势门类从假单胞菌门、酸杆菌门和放线菌门转变为芽孢杆菌门。
摘要
邻苯二甲酸二丁酯（DBP）的污染会带来严重的生态风险，因此需要有效的绿色修复策略。本研究构建了一个强大的微生物群落（DBP-Micro-con），并运用多组学整合方法系统阐明了其降解机制。群落分析表明，经过富集培养后，优势门类从假单胞菌门、酸杆菌门和放线菌门转变为芽孢杆菌门。该微生物群落在120小时内即可将DBP去除99.07%，远优于单独的单一菌株。它在pH 5–10、温度20–38°C的广泛环境下仍具有出色的稳定性，同时还能降解邻苯二甲酸二辛酯（DOP）及多种甾醇类杀菌剂。非靶向代谢组学分析发现，单丁基邻苯二甲酸酯（MBP）是降解中间体，且核苷酸和甘油脂代谢途径发生了变化。此外，通过对关键羧酸酯酶CES1281进行同源建模和分子对接，尽管其序列相似度较低，但仍能揭示其催化机制的结构特征，发现存在一个保守的催化三联体（Ser113-Asp166-His197），以及有助于稳定底物结合的关键疏水相互作用。总体而言，这些研究成果提升了人们对PAE生物降解的理论认识，为复合污染的修复提供了有价值的微生物资源与机制框架。
引言
邻苯二甲酸酯类（PAEs）是一类合成增塑剂，被广泛用于聚氯乙烯、涂料、化妆品及医疗设备中，用以提升材料的柔韧性和加工性能[1]。其中，邻苯二甲酸二丁酯（DBP）因其成本低廉且增塑效果优异，长期以来被大规模生产和使用[2]。但由于DBP并非与聚合物基质共价结合，因此在塑料产品的制造、日常使用及处理过程中，它很容易释放到土壤、水体和大气中。研究表明，DBP具有内分泌干扰作用，会影响生物的生殖发育，且在环境中具有一定的持久性和生物累积潜力。它已被美国环境保护局列为优先污染物[3][4]。
土壤是PAEs迁移和转化的主要归宿，而其中的微生物群落则是降解这些有机污染物的关键力量[5]。近年来，基于微生物的生物修复技术被视为处理PAE污染的绿色可持续策略。目前已分离鉴定出多种能够降解PAEs的细菌，它们主要属于假节杆菌属[6]、假单胞菌属[7]、鞘氨醇单胞菌属、戈尔登氏菌属[8]、红球菌属[9]以及丛毛单胞菌属[10]。这些微生物主要来源于农业废弃物填埋场、红树林湿地及沉积物，以及污水处理厂中的活性污泥。不过，目前大多数关于DBP降解的研究都集中在单个细菌分离株及其降解动力学上。虽然单一菌株能提供有用的机制信息，但它们可能无法完全反映受污染环境中的微生物相互作用，因为在实际环境中，污染物的转化往往是由微生物群落共同完成的，而非单一微生物的作用。尤其是，单个分离株的环境适应性可能有限，下游代谢过程可能不完整，底物特异性也可能较窄。与单一菌株降解相比，土壤堆肥、活性污泥以及细菌群落具有更好的环境适应性[11]。此外，富集后的微生物群落能够实现群落成员间的功能互补，分散代谢负担，并在环境条件变化时仍保持降解能力。这一特性在实地污染场景中尤为重要，因为DBP常常与其他疏水性或含酯类污染物一同存在，比如长链邻苯二甲酸酯类和农业化学品。因此，从群落层面评估DBP的降解情况，能够获得单一菌株系统难以提供的信息。
以往的研究已经识别出了DBP的水解产物，如单丁基邻苯二甲酸酯（MBP）和邻苯二甲酸（PA），同时也对多种能够降解PAEs的酶进行了研究[12]。然而，群落构建、降解性能、代谢响应、降解中间体以及酶功能之间的关系尚未得到充分整合。非靶向代谢组学这一新兴领域为揭示污染物降解过程中微生物代谢网络的变化提供了有力工具[13][14]。多项研究表明，通过分析代谢物和代谢途径的变化，代谢组学能够深入了解微生物群落在压力条件下的生化反应[15][16]。在此基础上，识别出催化关键反应的关键酶并阐明其作用机制，对于优化微生物的降解功能至关重要。DBP降解的第一步通常是酯键的水解，这一过程由羧酸酯酶催化，这类酶属于α/β-水解酶超家族，在细菌中广泛存在[17]。但目前针对PAE降解酶的研究大多还停留在基因和蛋白质特征分析阶段。虽然这类研究能提供基础性知识，但尚未深入探讨这些酶的三维结构及底物识别机制[18][19]。尤其是当目标酶与已知晶体结构的蛋白质序列相似度较低时，传统的功能注释方法就显得不够可靠，也无法满足功能验证的需求[20]。在这种情况下，结合同源建模和分子对接模拟，便可以在没有晶体结构的情况下预测酶的活性位点特征及其与底物的相互作用模式，从而为后续的酶修饰和固定化提供理论依据。
为弥补这些不足，本研究从受污染的土壤中富集出了能够降解DBP的微生物群落，进而评估了其在针对特定邻苯二甲酸酯类及含酯类农药时的降解效率、环境适应性以及底物范围。研究采用了高通量测序技术分析富集过程中的群落变化，利用LC-MS/MS技术鉴定DBP的降解中间体，通过非靶向代谢组学分析DBP利用过程中与葡萄糖对照组的代谢差异，同时还结合酶建模和异源表达技术，将与PS06828相同的羧酸酯酶CES1281与DBP及嘧菌酯的水解过程联系起来。因此，这项研究的价值在于将群落层面的表现与代谢物、代谢途径及酶层面的证据相结合，从而为理解和发展DBP生物修复策略提供更为全面的框架。
章节摘录
DBP降解微生物群落的富集与分离
首先将DBP溶解在丙酮中，制备浓度为5 mg/mL的储备液。为使DBP的最终浓度达到100 mg/L，向反应瓶中加入100 μL该储备液，待丙酮蒸发5分钟后，再加入5 mL MSM。作为液体富集培养的接种物，使用了第30天时经DBP处理（浓度为100 mg/kg）的土壤。选择土壤微宇宙中DBP浓度为100 mg/kg的条件，是为了给耐DBP的微生物提供较强的选择压力
DBP暴露与富集培养改变微生物群落结构
为研究微生物群落对DBP污染及随后富集培养的响应，基于原始土壤（对照组）、DBP污染土壤（DBP-Soil）以及液体富集得到的降解群落（DBP-Micro-con）的细菌群落组成，进行了主成分分析。前两个主成分解释了总方差的83.63%，其中PC1解释了75.21%的方差，PC2解释了8.42%的方差（见图1A）。
DBP带来的选择压力影响微生物群落构建
在污染物压力作用下微生物群落的结构动态，对于了解其生物修复潜力至关重要。在本研究中，虽然土壤中短期的DBP暴露并未显著改变整体群落结构，但液体富集过程却引发了显著的群落变化。Lei等人曾指出，在低浓度的PAEs存在下，细菌群落结构相对稳定，而高浓度的PAEs则
结论
本研究成功构建了一个功能强大的微生物群落DBP-Micro-con，为DBP及其共存有害物质的降解提供了一种有效的生物修复策略。从宏观性能来看，该群落具备极高的降解效率，能够在120小时内将DBP去除99.07%。此外，DBP-Micro-con在广泛的pH值和温度范围内都具有出色的环境适应能力，同时还具备降解DOP的多种功能
环境意义
邻苯二甲酸二丁酯（DBP）是一种具有环境危害性的增塑剂，它会不断从塑料产品中释放出来，积累在土壤和水体中，从而带来内分泌干扰和生态风险。因此，有效的修复措施必须在不同的环境条件以及存在其他污染物的情况下依然保持高效。本研究中的DBP-Micro-con在广泛的pH值和温度范围内都能高效去除DBP，同时还能够降解邻苯二甲酸二辛酯及多种含酯类杀菌剂，这表明
CRediT作者贡献说明
王伟军：撰写原始稿件、开展研究工作、负责数据整理。刘志民：负责结果验证、软件应用。刘晓路：负责资金筹集、数据整理。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关联。
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金的资助（项目编号：31500034）。
Weijun Wang|Zhimin Liu|Xiaolu Liu
北京科技大学化学与生物工程学院，中国北京市海淀区学院路30号，邮编100083
