STED显微镜揭示纳米塑料的时空命运：从膜接触到核周限制

《Journal of Hazardous Materials》：Spatiotemporal Fate of Nanoplastics: From Membrane Encounter to Perinuclear Confinement Revealed by STED Microscopy

　　

摘要

纳米塑料是普遍存在的环境污染物，但由于成像分辨率的限制，从与细胞膜接触至最终命运的亚细胞过程仍不甚明了。本研究采用刺激发射耗竭超分辨率显微镜技术，以纳米级精度观测单个纳米塑料在细胞内的完整迁移路径。借助光稳定的AIEgen核纳米塑料，我们能够分辨出单个纳米塑料，并实时追踪其与细胞内结构之间的纳米级空间关系。通过提高纳米塑料浓度，活细胞STED显微镜显示，纳米塑料的内化是一个主动的、由细胞迁移驱动的过程，包括由丝状伪足引发的探测、部分吞噬后释放颗粒，以及最终的垂直吸收，这一过程挑战了“膜接触必然导致生物积累”的传统观点。在细胞内，纳米塑料会快速移动到溶酶体靠近细胞核的区域（平均速度约为0.15微米/秒），其移动过程受溶酶体融合动态的影响。线粒体则会出现短暂的“接触即离开”现象，这可能与应激引起的环形形态变化及氧化应激加剧有关。STED技术的定量3D成像显示，在颗粒数量较少的情况下，传统2D成像对细胞内纳米塑料含量的估算可能高估100%。高分辨率STED显微镜能够区分真正的溶酶体包裹与仅仅是近距离存在的情况，从而揭示出一种独立于溶酶体的、纳米塑料在细胞核附近聚集的途径。这些发现凸显了STED显微镜在评估纳米塑料风险方面的潜力，也为理解纳米塑料在亚细胞层面的毒性作用提供了机制基础。

引言

塑料碎片在全球生态系统中的普遍存在已是既定事实。一旦进入环境介质，塑料废物会在紫外线辐射、机械磨损和微生物作用的共同作用下逐渐破碎[1]。这种持续的降解过程会产生不同大小的颗粒，从中等尺寸的塑料（5毫米至20厘米）、大微型塑料（1至5毫米）、小微型塑料（20至1000微米），一直到最小的纳米塑料（直径小于1微米），而后者越来越被认为是最为常见的塑料类型[2]、[3]。矛盾的是，这些最普遍存在的污染物却最不为人所了解。其主要问题并非缺乏毒理学研究，而是难以直接观察单个纳米塑料在生物系统中的去向及其进入细胞后的亚细胞相互作用。

荧光显微镜长期以来一直是研究外源颗粒被细胞摄取及在细胞内运输情况的主要工具，通过将荧光标记物连接到目标颗粒上，再追踪其随时间和空间的发光信号来进行分析[4]、[5]。对于微米级的颗粒，这种方法能够有效识别出单个塑料碎片，并在共聚焦显微镜的衍射极限分辨率下，确定它们与生物结构的关联[6]。然而，当用共聚焦显微镜观察直径小于该仪器横向分辨率的纳米塑料时，它们不会呈现为独立的颗粒，而只是模糊的斑点，往往与相邻颗粒或未结合荧光标记物产生的斑点难以区分[7]。尽管通过反卷积等计算后处理技术可以一定程度上提升图像清晰度，但这些方法仍无法达到突破衍射极限所需的精确空间分辨率。更重要的是，这样的斑点与邻近细胞器的确切空间关系——无论是位于囊泡腔内、附着在细胞器表面，还是仅在250纳米范围内经过——都只能依靠推测，而无法直接观察。这种不确定性不仅是一种技术限制，更从根本上影响了我们预测环境中暴露的生物体中纳米塑料的生物学命运和毒性潜力的能力，因为亚细胞位置最终决定了其生物学影响的程度和方式。

超分辨率显微镜技术，如刺激发射耗竭显微镜、结构照明显微镜、随机光学重建显微镜以及最小光子通量纳米显微镜，已经突破了传统光学显微镜的衍射极限，使得原本无法观察到的生物系统中的分子细节得以显现[8]。与需要额外计算处理才能重建图像的结构照明显微镜不同，刺激发射耗竭显微镜凭借其纯粹的物理分析特性，能够实现高达30纳米的分辨率，这一数值几乎是传统成像方法的十分之一[9]。这种独特的技术优势使得刺激发射耗竭显微镜能够在图像采集过程中直接生成高分辨率图像，避免了重建过程中可能出现的伪影，从而更准确地呈现真实结构。虽然刺激发射耗竭显微镜本身属于物理技术，但其输出结果仍可与反卷积等计算后处理方法相结合，进一步优化图像质量或提升信噪比[10]。这种“前端实现物理分辨率提升，后期通过计算进一步增强图像质量”的双重策略，使得刺激发射耗竭显微镜兼具强大功能与高度灵活性。

尽管具有这些技术优势，刺激发射耗竭显微镜的应用至今仍主要局限于少数几个成熟的研究领域。在过去十年中，该技术已被广泛用于解决细胞生物学和神经科学领域的诸多基础问题，比如解析核孔复合物的结构、追踪突触小泡的动态变化，以及研究各种内吞作用机制[11]、[12]、[13]。相比之下，它在环境毒理学领域，尤其是在塑料相关研究中的应用还处于起步阶段。迄今为止，只有少数研究尝试使用刺激发射耗竭显微镜成像纳米塑料，这些研究大多仅限于无细胞体系中的原理验证，或者是在整个生物体或组织层面定位颗粒，或是研究塑料在生物界面处的转移情况[14]、[15]。尽管这些研究为相关技术发展奠定了重要基础，但尚未追踪纳米塑料进入单个细胞后的运动轨迹。尤为关键的是，从纳米塑料最初与细胞膜接触开始，到最终到达某个亚细胞位置的全过程仍是个未知数，原因在于目前还没有系统地应用足够高的时空分辨率来研究这一问题。

本研究通过使用固定细胞模型和活细胞模型，充分利用刺激发射耗竭显微镜的功能，解析单个纳米塑料在细胞内的命运。首先，我们在人类皮肤细胞系中验证了刺激发射耗竭显微镜确实具备足够的分辨率，能够分辨出单个纳米塑料并将其与周围的细胞器区分开来。随后，我们利用二维活细胞刺激发射耗竭显微镜技术，实时观察纳米塑料与细胞相互作用、被细胞内化以及在其内部移动的过程。通过對固定细胞进行三维成像，我们获得了更为完整的体积图像，进而追踪了纳米塑料的积累规律，并确定了它们逐渐集中在细胞核周围的趋势。与以往仅限于无细胞系统或早期内化过程研究的刺激发射耗竭显微镜应用不同，本研究构建了从纳米塑料与细胞膜接触开始，到最终被限制在细胞核周围的全过程图景，为风险评估体系的建立提供了具体的机制依据。

章节节选

用刺激发射耗竭显微镜成像纳米塑料

我们所使用的核心为AIEgens、外壳为聚苯乙烯的纳米塑料，是从AIE研究所购买的（型号为NARPC-030，激发波长为488纳米，发射波长为610纳米）。其外部塑料外壳可防止封装在其中的荧光标记物渗入生物环境，从而避免对相关行为或毒性实验产生干扰。虽然这类模型纳米塑料的直径约为300纳米，处于共聚焦显微镜的衍射极限范围（约250纳米）之内，但通过该技术仍可实现对其精确追踪。

刺激发射耗竭显微镜在识别纳米塑料和细胞结构方面的更高分辨率

要了解纳米塑料的生物学效应，就需要明确其在细胞内的精确分布、运输路径及最终命运。然而，当多个纳米塑料聚集成团时，就会给研究带来技术障碍（如图1a所示）。在本研究中，我们使用了核心为AIEgens、外壳为聚苯乙烯的结构性纳米塑料，其发射光谱与刺激发射耗竭激光的波长（775纳米，详见图S2a）存在重叠。此外，这类纳米塑料还具有较强的发光特性。

结论

在本研究中，我们利用带有AIEgen核/聚苯乙烯壳结构的探针，通过刺激发射耗竭显微镜实现了对单个纳米塑料在细胞内的亚细胞追踪。活细胞STED显微镜实验表明，纳米塑料的摄取过程受到细胞迁移的主动调控，这一发现挑战了现有的生物积累模型。一旦被细胞内化，纳米塑料会向细胞核周围区域移动，并与溶酶体和线粒体发生短暂的“接触即离开”式相互作用，而这些相互作用又与应激引起的细胞形态变化密切相关。

环境意义

我们的研究结果揭示了纳米塑料在细胞层面行为所带来的重要环境意义。通过提高纳米塑料的浓度，我们发现纳米塑料的摄取是由细胞迁移驱动的主动过程。这一发现表明，纳米塑料的摄取依赖于细胞的迁移活动，从而挑战了现有的生物积累模型，同时也说明在活跃迁移的细胞中，纳米塑料的积累程度会更高。纳米塑料与线粒体的短暂接触或许有可能实现局部效应。

CRediT作者贡献说明

王文雄：研究指导，概念设计。孙安奇：初稿撰写，方法设计，实验实施。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢匿名审稿人提出的宝贵意见。本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号：42430709）和香港研究资助委员会一般研究基金（项目编号：11104225）的支持。王文雄还获得了香港研究资助委员会的5年期高级研究奖学金（项目编号：SRFS2425-1S06）的资助。

Anqi Sun|Wen-Xiong Wang

中国香港九龙香港城市大学能源与环境学院