Orai1介导的Ca2+内流调控棕色脂肪产热过程中的脂肪分解与线粒体激活

《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》：Orai1-mediated Ca2+ entry regulates lipolysis and mitochondrial activation in brown adipose thermogenesis

　　

摘要：棕色脂肪组织中的冷诱导产热对于维持能量稳态至关重要，然而，调控该过程的Ca²⁺依赖性机制仍不完全清楚。在此，研究人员鉴定出Orai1，即钙库操纵性钙内流（SOCE）通路的一个组分，是棕色脂肪组织产热激活的调节因子。利用棕色脂肪细胞特异性Orai1基因敲除小鼠模型，研究人员证明冷暴露与通过非经典机制的Orai1依赖性Ca²⁺内流相关。Orai1缺失会损害cAMP-蛋白激酶A（PKA）信号转导，降低脂肪水解酶和产热基因的表达，并减少线粒体Ca²⁺摄取和解偶联。这些缺陷最终导致冷不耐受、脂质积累和能量消耗减少。从机制上讲，Orai1促进Ca²⁺依赖性腺苷酸环化酶3（AC3）的激活，以此将细胞膜Ca²⁺内流与cAMP产生联系起来，并促进线粒体重塑和氧化代谢。这些发现支持了Orai1在协调棕色脂肪细胞中通往脂肪分解和线粒体通路的Ca²⁺内流方面发挥关键作用，并强调了Orai1作为以能量代谢受损为特征的代谢性疾病潜在治疗靶点的可能性。

**Orai1介导的Ca²⁺内流调控棕色脂肪产热过程中的脂肪分解与线粒体激活**

**研究背景与目的**

肥胖及其相关代谢疾病，如2型糖尿病、血脂异常和脂肪肝，仍是重大的公共卫生负担。尽管有药物和生活方式干预等治疗手段，但在增加能量消耗方面，通过激活棕色脂肪组织（BAT）来增强能量消耗的策略正重新获得关注。在成年人体内，BAT活性与肥胖程度和胰岛素抵抗呈负相关，刺激BAT可改善全身代谢指标，包括葡萄糖和脂质稳态。BAT在非颤抖性产热中发挥核心作用，冷暴露通过解偶联蛋白1（UCP1）介导的线粒体解偶联来产生热量。这种产热反应经典地归因于交感神经激活和β-肾上腺素能信号，通过cAMP-蛋白激酶A（PKA）通路促进脂肪分解和线粒体呼吸。尽管cAMP信号在冷诱导的BAT激活中的核心作用已明确，但新证据表明，Ca²⁺信号同样是棕色脂肪细胞代谢激活的关键整合因子。然而，在产热激活过程中，Ca²⁺内流通路的分子身份仍不清楚，Ca²⁺依赖性信号对产热调控的贡献程度也尚待阐明。Orai1-STIM1复合物经典地介导钙库操纵性钙内流（SOCE），近期研究表明其与冷触发的Ca²⁺内流相关。本研究旨在探讨Orai1是否在棕色脂肪细胞产热调控中发挥功能作用。

**研究方法**

研究人员利用棕色脂肪细胞特异性Orai1基因敲除（Orai1 BKO）小鼠模型以及互补的体外实验方法，研究了Orai1在棕色脂肪细胞中的作用。主要关键技术方法包括：1. 动物模型构建：将Orai1 floxed小鼠与Ucp1启动子驱动的Cre转基因小鼠交配，获得棕色脂肪细胞特异性Orai1基因敲除小鼠（Orai1 BKO），同窝未携带Cre的鼠作为对照。2. 细胞培养与基因沉默：从对照和Orai1 BKO小鼠肩胛间BAT中分离原代棕色前脂肪细胞，并在体外诱导分化。使用靶向Orai1、Stim1、Trpv2和Trpm8的siRNA进行基因沉默实验。3. 细胞内Ca²⁺成像：使用Fura-2 AM和Rhod-2 AM分别测量细胞内和线粒体Ca²⁺水平，通过温度控制（从37°C快速降至15°C）模拟冷刺激。4. 线粒体功能分析：利用Seahorse XF分析仪进行线粒体压力测试和脂肪酸氧化（FAO）评估。5. 分子与生化分析：通过蛋白质印迹（Western blotting）和定量实时PCR（qRT-PCR）检测相关蛋白和基因表达水平，并使用ELISA试剂盒检测cAMP浓度。

**研究结果**

**Orai1在产热条件下介导棕色脂肪细胞中的Ca²⁺内流**

通过活细胞Ca²⁺成像，研究人员发现急性冷暴露（37°C降至15°C）在原代棕色脂肪细胞中引发了显著的Ca²⁺内流。与靶向Trpv2和Trpm8的siRNA不同，沉默Orai1显著抑制了这种冷诱导的Ca²⁺反应。在重构的STIM1-Orai1成像实验中，急性冷刺激虽增加了STIM1和Orai1的斑块形成，但未增强其寡聚化，提示这是一种非经典的激活模式。在Orai1 BKO小鼠的原代棕色脂肪细胞中，冷诱导的Ca²⁺内流明显减弱，且进一步敲低Stim1未产生叠加效应。此外，冷暴露（急性或慢性）上调了BAT中Orai1的表达。

**Orai1缺失损害能量消耗并加剧代谢功能障碍**

在标准饲料条件下，Orai1 BKO小鼠脂肪量增加，且间接测热法显示其耗氧量和产热量显著降低，提示基础产热能力受损。在高脂饮食（HFD）喂养下，Orai1 BKO小鼠体重增加更快，出现更严重的葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗，BAT中脂质积累增加且肝脏脂肪变性加剧，血清甘油三酯和胆固醇水平升高，同时BAT中产热基因（如Ucp1、Dio2等）表达下调。

**Orai1缺失损害冷暴露下的产热反应和脂肪分解激活**

在冷暴露（4°C）实验中，Orai1 BKO小鼠核心体温下降更显著，肩胛间BAT区域皮肤温度更低，耗氧量和产热量均降低。组织学分析显示，Orai1 BKO小鼠的BAT在冷暴露后仍呈现脂质丰富的苍白外观，脂滴增大。在β-肾上腺素能激动剂（异丙肾上腺素或CL316243）刺激下，Orai1沉默的棕色脂肪细胞中甘油释放量显著减少，表明脂肪分解激活受损。冷暴露后，Orai1 BKO小鼠BAT中产热基因和脂肪分解标志物（Atgl、磷酸化Hsl）及产热调节因子（Ucp1、Pgc1a）的蛋白水平均降低。

**Orai1依赖性Ca²⁺内流使cAMP-PKA信号和线粒体解偶联得以实现**

冷暴露后，Orai1 BKO小鼠BAT中PKA亚基磷酸化水平、细胞内cAMP浓度以及Ca²⁺激活的腺苷酸环化酶3（Adcy3）的转录上调均显著减弱。在Orai1敲低的原代棕色脂肪细胞中，使用腺苷酸环化酶（AC）直接激活剂福斯克林（forskolin）处理，可恢复PKA活性和脂肪分解酶及UCP1的表达，但未能挽救线粒体质子泄漏的缺陷。在Orai1 BKO小鼠的原代细胞中，即使经过福斯克林刺激，PKA磷酸化和UCP1表达仍受损。这表明Orai1通过cAMP-PKA通路调控脂肪分解，同时通过Ca²⁺依赖性的非cAMP途径影响线粒体解偶联。

**Orai1介导的Ca²⁺内流与棕色脂肪细胞中线粒体Ca²⁺摄取、重塑和产热激活相关**

活细胞成像显示，Orai1沉默的棕色脂肪细胞中，由SOCE和冷刺激诱导的线粒体Ca²⁺摄取均显著减少。在人类棕色脂肪细胞中，沉默ORAI1同样减弱了冷诱导的细胞质和线粒体Ca²⁺反应。透射电镜观察发现，冷暴露后Orai1 BKO小鼠的BAT线粒体嵴密度降低，形态紊乱。分子水平上，Orai1 BKO小鼠BAT在冷暴露后氧化磷酸化（OXPHOS）复合物蛋白表达降低。在CL316243刺激下，Orai1缺陷细胞中线粒体DNA拷贝数增加受阻，质子泄漏和脂肪酸氧化（FAO）能力均显著减弱。

**结论与讨论**

本研究鉴定出Orai1是协调BAT产热激活的Ca²⁺信号调节因子。在产热激活过程中，Orai1介导棕色脂肪细胞中的局部Ca²⁺内流，同时激活cAMP-PKA依赖性的脂肪分解途径并促进线粒体Ca²⁺摄取。这些双重作用使Orai1成为连接Ca²⁺内流与细胞内产热反应的核心枢纽。研究结果表明，Orai1介导的Ca²⁺内流通过非经典途径（有限的STIM1参与）激活，促进腺苷酸环化酶3（Adcy3）的表达和cAMP产生，进而放大产热信号。同时，Ca²⁺内流直接促进线粒体Ca²⁺摄取、结构重塑和氧化代谢，从而支持产热功能。研究还发现，Orai1在产热适应过程中转录水平上调，且其在小鼠棕色脂肪细胞中发现的Ca²⁺信号机制在人类棕色脂肪细胞中同样存在。总之，该研究揭示了Orai1在BAT中作为Ca²⁺依赖性产热信号介导因子的功能，通过协调cAMP-PKA依赖的脂肪分解和Ca²⁺驱动的线粒体激活，为能量代谢受损的代谢性疾病提供了潜在的治疗靶点。