《Journal of Hazardous Materials》：Widespread environmental chemicals disrupt GRα and PPARγ signaling: evidence from an integrated experimental and computational screening approach
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摘要糖皮质激素受体α（GRα）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）是调控代谢与内分泌稳态的关键核受体。然而，环境污染物干扰这些受体的可能性目前尚未得到充分研究。我们评估了47种与环境相关的化合物对GRα和PPARγ的配体依赖性调节作用。初步筛选在HEK-293T细胞中通过
摘要
糖皮质激素受体α（GRα）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）是调控代谢与内分泌稳态的关键核受体。然而，环境污染物干扰这些受体的可能性目前尚未得到充分研究。我们评估了47种与环境相关的化合物对GRα和PPARγ的配体依赖性调节作用。初步筛选在HEK-293T细胞中通过转染双荧光素酶报告基因并在无细胞毒性剂量下进行，随后在Hepa1-6细胞和AML12细胞中分别通过qPCR分析典型靶基因的表达情况来进一步验证。在所测试的化合物中，TPHP和氯吡硫磷能够抑制GRα介导的转录，而苯甲酮-3、CdCl?和邻苯二甲酸二丁酯则能增强GRα依赖的转录。TBBPA-BHEE、TPHP、DBP、BP-3和CdCl?可增加PPARγ介导的转录。分子对接分析表明，GRα中的ASN564和THR739以及PPARγ中的TYR473等关键残基可能参与配体结合及配体-受体相互作用。结合已有文献和ToxCast生物活性数据进一步支持了筛选结果。值得注意的是，DBP能够激活GRα信号通路，据我们所知，这一现象此前尚未有报道。本研究建立了一种综合筛选框架，用于识别能够调控GRα和PPARγ信号通路的環境污染物，从而加深了我们对具有受体干扰作用的环境化学物质的理解。
引言
核受体是依赖配体的转录因子[1]、[3]、[4]。配体结合会引发构象变化，通过促进共抑制复合物解聚并招募共激活复合物来调控转录[5]、[6]。核受体负责控制代谢稳态、免疫功能、细胞增殖与分化[1]、[2]、[3]、[4]。在这一家族中，糖皮质激素受体α（GRα）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）因在内分泌与代谢调控中的关键作用以及与毒理学结果的相关性而备受关注[7]、[8]、[9]。GRα负责调控内源性糖皮质激素和合成皮质类固醇的作用，参与应激反应、免疫调节和能量代谢，其信号传导异常与免疫疾病和代谢功能障碍有关[10]、[11]。PPARγ则是脂肪生成、脂质储存和葡萄糖稳态的关键调节因子，该受体的异常激活与肥胖、胰岛素抵抗和代谢紊乱相关[12]。这两种核受体通过不同但互补的分子机制发挥其代谢调控功能。GRα主要通过直接与DNA中的糖皮质激素反应元件结合，以及与NF-κB和AP-1等转录因子之间的蛋白质-蛋白质相互作用来发挥作用[13]、[14]。而PPARγ则与视黄酸X受体形成异二聚体，从而调控与脂肪细胞分化、脂质代谢和胰岛素敏感性相关的基因表达[15]。
随着工业化和城市化的推进，人类接触的结构多样的环境污染物的数量大幅增加。阻燃剂、全氟和多氟烷基物质、塑料增塑剂、农药、个人护理产品、重金属以及多环芳烃等常常在环境样本和人体生物监测研究中被检测到[16]。这些环境化学物质可能通过模拟或阻断内源性配体与GR和PPAR的结合来干扰这些信号通路，虽然相关实验数据仍较为有限，但它们可能对免疫功能紊乱和代谢异常产生影响[17]。例如，某些塑料增塑剂如邻苯二甲酸二丁酯已被报道能够激活PPARγ信号通路，而包括苯甲酮-3在内的紫外线过滤剂以及多种有机磷酯类物质则在PPARγ和GRα信号通路中表现出内分泌干扰作用[18]、[19]。美国环保局开发的毒性预测程序ToxCast采用体外高通量筛选方法对环境污染物进行优先排序和特性分析[20]。ToxCast的内分泌筛查主要聚焦于雌激素受体和雄激素受体，但也对包括PPAR和GR信号通路在内的多种生物学靶标进行了评估。在本研究中，我们利用一种综合体外筛选方法，评估了47种属于七大类环境污染物的外源化合物对GRα和PPARγ受体介导的转录活性的影响。通过分子对接分析模拟候选干扰物与受体配体结合口袋之间的相互作用，并将候选干扰物与现有文献报道及ToxCast的高通量生物活性数据进行了比较。通过整合体外筛选试验、分子对接分析以及文献和ToxCast数据，本研究旨在识别能够干扰GRα和PPARγ信号通路的環境污染物，并为后续的毒理学研究确定优先级。
章节节选
化学物质及其分类
我们选择了47种对人类健康和环境具有潜在危害的外源化合物，以评估它们对GRα和PPARγ信号通路的干扰作用。这些化合物包括14种阻燃剂、3种全氟和多氟烷基物质、9种塑料增塑剂、10种农药、6种个人护理产品、2种重金属以及3种多环芳烃。这些化合物的名称、缩写和CAS编号列于表1中。
细胞培养
HEK-293T细胞和AML12细胞被持续培养
外源化合物的细胞存活率检测
通过CCK-8试验检测了所测试化合物在HEK-293T细胞中的细胞毒性，根据拟合后的剂量-反应曲线，当细胞存活率低于85%时视为具有细胞毒性（见图1）。共有33种化合物在浓度高达100μM或更高时仍能使细胞存活率保持在85%以上，其中包括11种有机磷酯类物质、8种塑料增塑剂以及14种其他类别的化合物，这表明
讨论
环境中存在多种外源化学物质，它们可通过饮食摄入、吸入和皮肤接触等多种途径进入人体[24]、[25]。包括国家健康与营养调查在内的各种人体生物监测项目显示，大量人群暴露于多种环境化学物质中，这凸显了它们的潜在生物学意义[26]、[27]。GRα负责调控内源性
环境影响说明
GRα和PPARγ是调控代谢与内分泌稳态的关键核受体。然而，环境污染物干扰这些受体的可能性目前仍缺乏足够研究。本研究建立了一种综合筛选框架，用于识别能够调控GRα和PPARγ信号通路的環境污染物，发现了此前未被认识到的具有受体干扰作用的化学物质，同时也强调了与之相关的潜在代谢和内分泌健康风险
CRediT作者贡献说明
马雅：方法学研究。王春峰：方法学研究、实验分析。魏彦红：论文撰写与编辑、研究指导、概念设计。王丹阳：论文初稿撰写、可视化分析、方法学研究、实验分析。王建社：论文撰写与编辑、研究指导、资金获取、概念设计。周莹莹：方法学研究、实验分析。刘文娇：论文初稿撰写、验证分析、方法学研究、实验分析。钟晓玲：方法学研究、实验分析。
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金委员会国际（区域）合作研究重点项目的支持（项目编号：W2511014）。
Danyang Wang|Wenjiao Liu|Yingying Zhou|Xiaoling Zhong|Chunfeng Wang|Ya Ma|Yanhong Wei|Jianshe Wang
中国烟台大学药学院，分子药理学与药物评价重点实验室，烟台264005
