核苷修饰mRNA编码α-半乳糖苷酶A改善人iPSC来源心肌细胞法布里病表型

《Advanced Science》：Nucleoside-Modified mRNA Encoding Alpha-Galactosidase A Ameliorates Fabry Disease Phenotypes in Human IPSC-Derived Cardiomyocytes

　　

溶酶体贮积病法布里病由α-半乳糖苷酶A（α-galactosidase A，GLA）缺乏所致，引起糖鞘脂底物尤其是球三糖酰基鞘氨醇（globotriaosylceramide，Gb3）过度蓄积。其分子机制尚未完全阐明，多系统并发症最终导致早逝，心力衰竭为主要死因。现有疗法不足以充分控制法布里病，仅能延缓进展。临床前研究提示，系统性递送核苷修饰GLA mRNA（modGLA）在降低心脏糖鞘脂水平方面优于现有疗法，但modGLA能否在细胞水平挽救动物模型难以再现的法布里心肌病表型仍不清楚。研究人员利用人iPSC来源心肌细胞转录组与功能分析，在两种新法布里心肌病模型中考察典型表型。这些人法布里病心肌细胞呈现广泛转录失调、凋亡、线粒体功能障碍、活性氧（reactive oxygen species，ROS）处理受损、收缩性改变及钙瞬变衰减参数增强；机制上磷酸受纳蛋白（phospholamban，PLN）超磷酸化可能参与钙调控异常。一致地，modGLA治疗恢复GLA活性、减少糖鞘脂沉积，并正常化包括PLN超磷酸化与钙衰减参数在内的分子改变，支持modGLA作为法布里病有前景的治疗策略。

研究背景与立项依据

法布里病（Fabry disease，OMIM #301500）是一种X连锁溶酶体贮积病，因GLA基因突变致α-半乳糖苷酶A缺乏，使主要底物球三糖酰基鞘氨醇（Gb3）在组织内蓄积，逐步引发脑、肾、心血管多系统损害，心力衰竭是男女患者首要死因。既有酶替代疗法（enzyme replacement therapy，ERT）虽可暂缓进展，却难以清除心肌细胞Gb3或改善心功能，20年随访亦未逆转；药理伴侣仅适用于部分可矫正突变。经典GLA-KO小鼠与大鼠模型无法忠实再现人法布里心脏病表型。SARS-CoV-2疫情后核苷修饰mRNA平台成熟，临床前小鼠与非人灵长类研究提示modGLA在心肾Gb3及lyso-Gb3清除上优于ERT或联合方案，但人源心肌细胞水平除Gb3下降外能否挽救凋亡、氧化应激、钙处理异常等功能表型尚无证据。为此，研究人员在《Advanced Science》报道的工作中以健康供体hiPSC为源头构建患者非依赖性GLA-KO心肌细胞模型，并以携带c.959A>T错义突变的法布里患者hiPSC（F01）及其prime editing校正同基因对照（F01-IC）为第二模型，系统评估modGLA在成熟人心肌细胞中对法布里病细胞表型的挽救能力与机制。

主要技术方法概览

研究人员采用CRISPR/Cas9由健康供体WT hiPSC获得GLA-KO克隆，另取已建法布里患者hiPSC（F01）并以prime editing校正为F01-IC；两系均按双相Wnt调制方案分化为cTnT阳性率约95%的心肌细胞，于分化后65±5天（长时程成熟窗）进行分析。modGLA以m1ψ置换全部U、CleanCap AG共转录加帽、IP-RP-HPLC纯化去除dsRNA副产物，部分封装为SM-102脂质纳米颗粒（LNP）。功能端：bulk RNA-seq（rRNA去除）做差异基因与g:profiler富集；Fura2-AM比率荧光记录钙瞬变；Western blot定SERCA2a、NCX1、总PLN及pSer16-PLN；Caspase-Glo 3/7、DCFDA、TMRE流式测凋亡敏感、ROS、线粒体膜电位；xCGE-LIF定量糖鞘脂聚糖；另以猪活心肌切片（LMS）及人精密肝切片（hPCLiS）作离体转运验证。

研究结果

2.1 GLA缺失致hiPSC心肌细胞Gb3蓄积

GLA-KO心肌细胞α-Gal A酶活性近零，40至65天cTnT阳性细胞内Gb3荧光信号渐进累积；透射电镜显示65天肌节超微结构未见明显异常，确认代谢表型而非结构崩解为先导。

2.2 转录组再现法布里病关键表型

65天WT与GLA-KO心肌细胞bulk RNA-seq得3359个差异基因（base mean>5，q<0.1），富集于凋亡、线粒体能量代谢、ROS、心肌收缩、糖尿病心肌病及Ras/MAPK、TGF-β、整合素信号，印证模型转录层面效度。

2.3 核苷修饰GLA mRNA有效恢复酶活性

modGLA经IVT、m1ψ修饰、CleanCap AG加帽与IP-RP-HPLC纯化，Dot Blot证实dsRNA清除，变性胶示1606 nt完整条带；6 μg/10^6细胞剂量在GLA-KO心肌细胞剂量依赖恢复α-Gal A活性且不损活力、免疫原性低于未修饰mRNA，选为后续周疗剂量。

2.4 酶缺表型被modGLA显著挽救

四周周疗后，GLA-KO心肌细胞α-Gal A活性回升，Gb3荧光定量降约66.4%，xCGE-LIF示Gb3、galactobiosylceramide、nLc6同步下降；阿霉素应激下Caspase 3/7活性较对照组高，modGLA使之降约32%；H2O2挑战6小时ROS生成峰值降约41.8%；TMRE示静息Δψm去极化偏移及阿霉素后恶化均被modGLA部分回拉。

2.5 GLA-KO心肌细胞钙瞬变衰减加速伴PLN超磷酸化

Fura2-AM示疾病组钙瞬变衰减速度增快、50%衰减时间缩短、心律失常钙瞬变比例由7.9%降至modGLA后1.7%；Western blot见NCX1与SERCA2a蛋白量不变，而PKA靶位pSer16-PLN/总PLN显著升高，modGLA使其正常化；PKA全局底物磷酸化水平不变，但疾病组对PKI响应减、对Calyculin A响应增，modGLA回调，提示PLN-SERCA-PKA区室化信号异常而非全局PKA亢进。

2.6 患者源模型交叉验证钙信号为核心驱动

F01与F01-IC心肌细胞bulk RNA-seq与GLA-KO/WT并集分析，方向一致差异基因富集于钙信号、心肌收缩、ROS、ECM-受体、程序性死亡；跨模型均见收缩时间加速、幅度下降且modGLA部分复原；F01心肌细胞pSer16-PLN同样升高并被modGLA-LNP部分逆转；LNP-modGLA在猪LMS与人hPCLiS中均提升α-Gal A活性，且在患者源心肌与内皮细胞降低Gb3。

讨论与结论译文

研究人员指出，GLA丧失在hiPSC心肌细胞中引出凋亡敏感、ROS清除受损、Δψm异常等已知表型，且细胞对阿霉素与H2O2等应激的超敏性提示生活期感染、炎症、饮食或药物毒素等非遗传应激可能参与法布里病基因型-表型关联模糊。在钙处理异常机制上，本研究首次以PLN Ser16被PKA超磷酸化解释既往Birket等观察到的肌浆网钙负荷增高与瞬变幅度增大：PLN对SERCA2a抑制解除→胞质钙回收加速→衰减提速，且PKA锚定蛋白扰动实验排除全局PKA变化，指向PLN-SERCA-PKA轴区室化重排；PI3K-Akt与Ras/MAPK富集提供上游线索。Huurne等曾在14–21天年轻心肌细胞每两日给药示modGLA降Gb3，本研究推至65天成熟阶段并以周疗/单剂证明已成形蓄积仍可部分清除，对迟诊临床场景具转化意义；猪LMS与人hPCLiS的LNP验证强化系统递送潜力。部分表型仅部分挽救归因于残余Gb3与自噬-溶酶体功能受损，更长疗程或环形编码RNA延半衰期是后续方向，不可逆表观改变则需联合策略。

结论节译：研究人员提供法布里心肌病早期细胞表现（尤指伴PLN超磷酸化影响的钙处理异常）的机制洞察；数据表明mRNA疗法可在人iPSC来源心肌细胞中挽救法布里病典型细胞表型，支持其作为法布里病未来治疗策略的潜力。