钴胺素依赖性O-脱甲基化：从人肠道微生物Blautia producta MRG-PMF1中分离的酶催化多甲氧基黄酮的O-脱甲基化

《Advanced Synthesis & Catalysis》：Cobalamin-Dependent O-Demethylation of Polymethoxyflavones by Enzymes Isolated From the Human Gut Microorganism Blautia producta MRG-PMF1

　　

芳基甲基醚的O-脱甲基化是一种宝贵的转化，通过降解丰富的木质素衍生化合物和其他天然产物，在生态循环中发挥关键作用。化学O-脱甲基化需要苛刻的反应条件；因此，对生物催化解决方案的需求很高。在这里，研究人员描述了来自人肠道微生物Blautia producta MRG-PMF1的两种钴胺素（Cobalamin）依赖性酶系统，即甲基转移酶I（Methyltransferase I，MT1）与类咕啉蛋白（Corrinoid protein，CP）配对，催化多甲氧基黄酮（Polymethoxyflavones）的O-脱甲基化。通过高效液相色谱-串联质谱（HPLC–MS/MS）分析和化学及酶法合成的半甲氧基黄酮（Hemimethoxyflavones）的核磁共振（NMR）光谱，确定了酶对10-甲氧基黄酮分子的区域选择性。其中一种酶BpMT1a以区域选择性方式表现出连续O-脱甲基化，导致底物完全脱甲基化。反应过程中仅累积了某些半甲氧基化中间体，表明在CP交换过程中某些中间体仍结合在活性位点。BpMT1b对所有测试黄酮的4′-OMe位置表现出严格的区域选择性O-脱甲基化。在BpMT1b对三种甲氧基黄酮的放大反应中实施了光催化再生系统，使得纯化出足够数量的产物用于NMR表征。通过这些发现，研究人员将钴胺素依赖性O-脱甲基酶的使用从简单的脱甲基化工具转变为复杂天然产物的更精细的后期功能化平台。

**研究背景与问题**
芳基甲基醚在自然界广泛存在，尤其在木质素和天然产物中丰富。化学方法脱甲基化通常需要强路易斯酸（如三溴化硼）和苛刻条件，且区域选择性控制差，难以用于多甲氧基化复杂分子的选择性脱甲基。酶促脱甲基化可通过氧化途径（氧合酶）或厌氧钴胺素依赖性O-脱甲基酶实现。天然系统包含甲基转移酶I（MTI）、甲基转移酶II（MTII）、类咕啉蛋白（CP）和活化酶（AE），但近年简化至仅用MTI和CP，通过非天然甲基受体或光敏再生策略。然而，这些MTI的底物范围限于小芳香化合物，识别能处理大分子（如多甲氧基黄酮PMFs）的MTI具有重要意义。J. Han等人曾分离出可脱甲基PMFs的产乙酸菌Blautia producta MRG-PMF1，全细胞反应显示其能顺序、区域选择性脱甲基PMFs，提示该菌株携带相关基因。本研究旨在从该菌基因组中鉴定MTI候选基因，体外表征其催化PMFs O-脱甲基的活性，并探索区域选择性和连续脱甲基机制，为稀有半甲氧基黄酮（HMFs）的合成提供平台。论文发表在《Advanced Synthesis》。

**主要技术方法**
研究人员通过多序列比对（Clustal Omega）从B. producta MRG-PMF1基因组（GenBank: CP035945.1）中鉴定出17个候选MTI基因，基于锌结合基序、BLAST分类和AlphaFold3共折叠预测筛选。候选基因经密码子优化后克隆至pET-28a载体，在E. coli BL21 Rosetta (DE3)中表达，使用Ni-NTA亲和层析纯化。CP（BpCPa）克隆至pET-29b，纯化后与羟钴胺素（hydroxocobalamin）重构。酶反应在厌氧手套箱中进行，以Ti(III)柠檬酸盐或DTT为电子供体，通过HPLC、HPLC–MS/MS和NMR分析产物。针对放大反应，采用光催化再生系统（5-脱氮核黄素或荧光素/曙红Y，400 nm LED照射），并添加2-羟丙基-β-环糊精（HPCD）增加底物溶解度。

**研究结果**

**2.1 生物信息学酶发现与表征**
基因组分析发现17个MTI候选基因，仅一个位于与CP、MTII、AE共存的生物合成基因簇中。其余MTI分散于基因组，可根据锌结合位点（天冬氨酸和半胱氨酸差异）分为两组。还鉴定出6个CP、2个MTII和2个AE候选基因。所有17个MTI和6个CP在E. coli中异源表达并纯化，仅BpCPa能结合钴胺素并显示O-脱甲基酶活性。从活性筛选中选出BpMT1a和BpMT1b进行pH、温度、共溶剂耐受性和热稳定性优化。两者最适pH为6.0（BpMT1a: 5.5±0.6 min^-1，BpMT1b: 13.6±0.4 min^-1），最适温度分别为45 °C（BpMT1a: 6.6±0.2 min^-1）和40 °C（BpMT1b: 9.2±0.5 min^-1）。锌离子可增强活性（EDTA处理后添加锌的初始速率约为无锌时的3-8倍）。DMF和DMSO作为共溶剂时，1% DMF活性最高。热稳定性良好，40 °C孵育21.5 h后仍保留约75%残留活性。

**2.2 底物筛选**
17个MTI候选酶对2种呋喃香豆素（1, 2）和10种甲氧基黄酮（3–12）进行测试，仅BpMT1a和BpMT1b显示活性。BpMT1b严格选择性脱甲基4′-OMe基团（底物10, 11, 12），对无4′-OMe的底物3活性低。BpMT1a优先脱甲基7-、3′-和4′-OMe，对多甲氧基底物显示顺序脱甲基，中间产物（如8, 9）累积少，最终产物（如16, 21, 23）为主要产物。稳态动力学分析显示，BpMT1a对中间体8（KM 36.3±6.2 μM，kcat 4.7±0.2 min^-1）和9（KM 292.8±43.1 μM，kcat 27.6±2.3 min^-1）的催化效率远高于全甲氧基化的6（KM 162.5±17.5 μM，kcat 2.4±0.1 min^-1）。BpMT1b对10的kcat为94.3±2.9 min^-1，KM为16.0±2.3 μM，催化效率达97,830 M^-1 s^-1，且对无3′-OMe的底物活性极低。两种MTI对CP的KM均>100 μM（BpMT1a: 120.4±22.8 μM，BpMT1b: 182.2±30.5 μM），表明CP在体内可能高表达或脱甲基对生存非必需。

**2.3 顺序与连续O-脱甲基化**
通过构建底物6和10的反应进程曲线，发现BpMT1a催化下主要产物为完全脱甲基产物（16, 22），中间体（8, 9, 18, 20）累积极少。单周转实验（限制CP-Cbl(I)为20 μM，加入20 μM BpMT1a和200 μM 6）后，再补充20 μM CP-Cbl(I)，观察到16浓度从0.9 μM跃升至3.9 μM，而8和9也增加但比例不变。这表明中间体在CP交换过程中仍结合在BpMT1a活性位点，可能通过180°翻转暴露剩余甲氧基给新结合的CP-Cbl(I)，类似磷酸己糖变位酶机制。

**2.4 放大O-脱甲基化系统**
为鉴定产物结构，对BpMT1b催化10, 11, 12的产物进行NMR分析。采用光催化再生系统（5-脱氮核黄素，400 nm LED）和HPCD增溶，优化后使用DTT代替Ti(III)柠檬酸盐以简化系统。在50 mL反应中，25 mg底物经20 h反应，10, 11, 12的转化率分别为26%, 13%, 25%。制备型HPLC纯化得到产物18（2.6 mg）、23（3.0 mg）和24（1.8 mg），经NMR确认。HPCD的加入使初始速率降低10倍，可能由于底物和光敏剂被包封降低反应速率，但光催化系统提高了氧气耐受性。

**总结与讨论**
讨论部分指出，HPCD导致的速率降低是底物可用性和光敏剂寿命的妥协。光催化体系虽利于放大，但光穿透限制需专门反应器设计。研究结论翻译如下：
在本稿中，研究人员首次展示了通过分离酶对PMFs进行钴胺素依赖性O-脱甲基化。通过生物信息学酶发现，观察到B. producta MRG-PMF1含有17个推定MTI基因，表明其具有广泛的钴胺素依赖性O-脱甲基化代谢潜力，也可能包括N-、S-和Cl-脱甲基化。在这17个MTI中，BpMT1a和BpMT1b催化了多种PMFs的O-脱甲基化。BpMT1a以连续和区域选择性方式依次脱甲基4′→7→3′→5，与先前报道的全细胞脱甲基一致。此外，BpMT1a表现出独特机制，某些产物中间体在反应中不累积；单周转实验表明该机制很可能是由于中间产物在CP交换过程中未从活性位点解离。另一方面，BpMT1b表现出严格的区域选择性，仅对4′-OMe基团进行单次O-脱甲基化。最后，研究人员通过实施光催化钴胺素再生系统，用BpMT1b在25 mg规模上对三种底物10, 11, 12进行了放大O-脱甲基化，纯化出足够量的产物用于NMR表征。该工作表明，整合生物信息学酶发现、区域选择性控制和光催化优化，为合成稀有半甲氧基黄酮提供了平台。