OTUD6A介导的PRDX1去泛素化通过恢复线粒体功能保护口腔溃疡

《Advanced Science》：OTUD6A-Mediated Deubiquitination of PRDX1 Protects Against Oral Ulcer by Restoring Mitochondrial Function

　　

口腔溃疡（OU）作为患病率最高且易复发的口腔黏膜病变，其发病机制不清，阻碍了有效治疗的发展。虽然新出现的证据表明去泛素化酶（DUBs）可能在口腔疾病中发挥作用，但它们在OU中的功能仍不清楚。在本研究中，研究人员筛选了OU小鼠舌组织中DUBs的表达，并鉴定出含OTU结构域蛋白6A（OTUD6A）是OU进展中下调最显著的DUB。功能研究表明，OTUD6A缺失加剧了小鼠OU病理，并相应地抑制了人口腔角质形成细胞（HOKs）的增殖和迁移，同时促进了其凋亡。机制研究揭示，OTUD6A直接结合过氧化物还蛋白-1（PRDX1），并通过催化残基C152切割其K48连接的多聚泛素链在赖氨酸136位点（K136），从而稳定HOKs中的PRDX1。OTUD6A缺失导致PRDX1降解，增强了线粒体氧化应激和功能障碍，最终损害HOKs功能，而OTUD6A过表达挽救了HOKs功能异常。重要的是，局部施用重组OTUD6A蛋白显著加速了小鼠OU愈合。总之，这些结果确定了OU病理中一个新的OTUD6A-PRDX1轴，并将OTUD6A作为OU的一个有希望的治疗靶点。

**研究背景与问题**
口腔溃疡（OU）是最常见且疼痛的口腔黏膜疾病，影响超过25%的人群，同时也是癌症患者放化疗的常见并发症。其病理表现为上皮不连续、炎症浸润和灰白色假膜，因口腔黏膜高度神经支配导致显著疼痛，影响咀嚼、吞咽和整体生活质量。OU的病因多因素且不完全清楚，涉及创伤、感染、过敏等因素，并可能与皮肤病、自身免疫病、肿瘤、炎性肠病等相关。然而，在许多病例中，包括复发性阿弗他溃疡，确切病因尚不明确。目前OU治疗主要依赖局部皮质类固醇、全身免疫调节剂和镇痛药，仅提供对症缓解，缺乏有效疗法。明确诊断生物标志物和靶向治疗的缺失，凸显了揭示OU核心病理机制以寻找更有效治疗方法的迫切性。

**研究目的**
泛素化是调节蛋白质稳定性和功能的关键翻译后修饰，而去泛素化酶（DUBs）通过切割泛素共轭物精确平衡这一可逆过程。DUBs通过调节蛋白质稳定性和功能影响多种疾病发病机制，已成为炎症、代谢和免疫疾病（包括糖尿病和脓毒症）的有希望的治疗靶点。已有证据将特定DUBs（如OTUD1、A20、CYLD和UCH-L1）与牙周炎发病机制相联系，但口腔疾病研究主要集中于牙周炎和头颈癌，其他口腔疾病严重缺乏探索，特别是调控OU发病的特定DUB尚未被鉴定。DUB超家族包含六个主要家族，其中卵巢肿瘤结构域（OTU）蛋白酶家族是最大且最关键的一类。研究人员通过定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）分析OTU家族基因，发现含OTU结构域蛋白6A（OTUD6A）在OU进展中下调最显著，提示其可能参与OU发病。OTUD6A是一种新近被鉴定的去泛素化酶，可调节先天免疫应答和炎症信号通路，在癌症、免疫和其他炎症性疾病中有明确作用，但其在OU中的具体调节机制尚不清楚。本研究旨在阐明OTUD6A在OU病理中的作用及其分子机制，并探索其作为治疗靶点的潜力。论文发表在《Advanced Science》。

**研究人员开展的研究与结论**
研究人员通过体内外实验系统研究了OTUD6A在OU中的功能。在体内，利用CRISPR-Cas9技术构建Otud6a全身敲除小鼠（Otud6a^-/-），发现Otud6a缺失显著加重了醋酸诱导的OU进展，表现为溃疡面积增大、深度增加、炎症加剧、胶原沉积减少和凋亡增加。在体外，使用H₂O₂诱导的人口腔角质形成细胞（HOKs）损伤模型，发现OTUD6A敲低进一步降低了细胞活力、抑制迁移并促进凋亡，而OTUD6A过表达则有效挽救这些损伤。机制上，通过免疫共沉淀（Co-IP）联合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）筛选出PRDX1为OTUD6A的结合底物，并验证了OTUD6A的C端结构域（CTD，残基276-288）与PRDX1的N端结构域（NTD，残基1-40）直接结合。OTUD6A通过其催化残基C152特异性切割PRDX1上K48连接的多聚泛素链，且去泛素化位点为PRDX1的K136残基，从而稳定PRDX1蛋白水平。进一步研究发现，OTUD6A缺失导致PRDX1降解，增强线粒体氧化应激和功能障碍（表现为总ROS和mtROS升高、线粒体膜电位降低、ATP减少），而PRDX1过表达可逆转这些效应。使用线粒体靶向抗氧化剂MitoQ也证实了mtROS升高介导了OTUD6A缺失后的HOKs功能障碍。重要的是，PRDX1敲低消除了OTUD6A过表达的保护作用，表明OTUD6A功能依赖于PRDX1。最后，研究人员利用课题组前期开发的HmA纳米颗粒（一种安全、长效的蛋白质递送系统）封装重组OTUD6A蛋白（OTUD6A@HmA），其具有pH响应性释放特性，可在酸性溃疡微环境中靶向释放。局部递送OTUD6A@HmA显著促进了小鼠OU愈合，减轻炎症、增加胶原沉积并减少凋亡。这些结果确立了OTUD6A-PRDX1-线粒体轴在OU病理中的关键作用，并将OTUD6A定位为有前景的治疗靶点。

**主要关键的技术方法**
1. **动物模型构建**：采用CRISPR-Cas9技术（来源：Gempharmatech，南京）构建Otud6a全身敲除小鼠（C57BL/6背景），并通过醋酸诱导建立小鼠OU模型。
2. **蛋白质组学与相互作用鉴定**：利用免疫共沉淀（Co-IP）联合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行相互作用组分析，筛选OTUD6A的潜在底物。
3. **功能与机制研究**：通过qRT-PCR、Western blot、免疫荧光、Co-IP、泛素化检测、MTT法、TUNEL染色、划痕实验、ROS检测（DCFH-DA、Mitosox、TMRM、ATP检测）评估细胞功能、凋亡、迁移及线粒体状态。
4. **纳米药物递送系统**：使用课题组前期开发的HmA纳米颗粒（由Zn²⁺和组氨酸自组装形成）封装重组OTUD6A蛋白，通过动态光散射、扫描电镜、透射电镜表征，并评估其pH响应性释放特性及体内治疗效果。

**研究结果**
**2.1 OTUD6A Deficiency Aggravated the Tissue Destruction of OU**
通过qRT-PCR分析小鼠溃疡和正常舌组织，发现Otud6a在OTU家族成员中下调最显著，且OTUD6A蛋白水平在溃疡组织中明显降低。在Otud6a^-/-小鼠中，溃疡面积更大、深度更深，临床评分更高，疼痛行为（面部擦拭次数和摩擦时间）增加。组织病理学显示，Otud6a缺失导致上皮广泛缺失、基底膜破坏、明显炎症细胞浸润、胶原沉积减少以及凋亡活性增加。
**2.2 OTUD6A Rescued the Cellular Damage of HOKs**
在H₂O₂诱导的HOKs损伤模型中，OTUD6A蛋白水平下调。OTUD6A敲低进一步降低了细胞活力，增加了凋亡（TUNEL染色阳性），并抑制了迁移（划痕实验）。而OTUD6A过表达则有效恢复了细胞活力，减轻了凋亡，并增强了迁移能力。
**2.3 OTUD6A Directly Bound to PRDX1 and Deubiquitinated PRDX1 at K136 Residue By Its Active Site C152**
Co-IP结合LC-MS/MS鉴定出PRDX1为OTUD6A的潜在底物，并在大鼠舌组织、HEK-293T细胞和HOKs中验证了直接相互作用。免疫荧光显示两者在HOKs中共定位。结构域分析表明，OTUD6A的C端结构域（CTD，残基276-288）与PRDX1的N端结构域（NTD，残基1-40）结合。OTUD6A通过其催化残基C152特异性去除PRDX1上的K48连接多聚泛素链，而非K63链，并进一步确认去泛素化发生在K136残基。
**2.4 PRDX1 and OTUD6A Attenuated Mitochondrial Oxidative Stress and Dysfunction of HOKs**
PRDX1过表达保护HOKs免受H₂O₂损伤，表现为活力增加、凋亡减少、迁移恢复，并缓解线粒体功能障碍（降低总ROS和mtROS、恢复MMP和ATP）。OTUD6A染色质缺失加剧了H₂O₂诱导的线粒体功能障碍，而OTUD6A过表达则减轻了这些异常。使用线粒体靶向抗氧化剂MitoQ处理OTUD6A敲低的HOKs，可显著挽救细胞活力、减少凋亡并恢复迁移，证实mtROS升高是OTUD6A缺失导致HOKs功能障碍的关键因素。
**2.5 PRDX1 Abolished the Cellular Damage and Mitochondrial Dysfunction Enhanced by OTUD6A Deficiency**
OTUD6A过表达增加PRDX1蛋白水平但不影响其mRNA水平，且减缓PRDX1降解。OTUD6A敲低降低PRDX1蛋白水平。PRDX1过表达逆转了OTUD6A敲低导致的HOKs细胞损伤（活力下降、凋亡增加、迁移抑制）和线粒体功能障碍（ROS升高、mtROS升高、ATP降低、MMP下降）。反之，PRDX1敲低消除了OTUD6A过表达的保护作用，表明OTUD6A的保护功能很大程度上依赖于PRDX1。
**2.6 OTUD6A@HmA Enhanced the Healing of OU in Mice**
利用HmA纳米颗粒封装重组OTUD6A蛋白（OTUD6A@HmA），其包封率为94.4%，载药量为8.18%，呈球形，粒径约63 nm，具有pH响应性释放特性（酸性条件下加速释放）。体外实验表明，OTUD6A@HmA可被HOKs摄取，增加OTUD6A蛋白水平，并以剂量依赖方式促进HOKs迁移。体内实验显示，局部施用OTUD6A@HmA可剂量依赖性地促进小鼠OU愈合，表现为溃疡面积和深度减小、体重减轻减少，组织学上炎症减轻、上皮下细胞增殖增加、胶原沉积增多，并减少凋亡。

**讨论与结论**
本研究首次报道了DUB在OU病理中的功能作用，鉴定OTUD6A为OU的保护因子。OTUD6A缺失加剧溃疡严重程度，而通过HmA纳米颗粒递送OTUD6A蛋白显著促进小鼠OU愈合。机制上，OTUD6A通过结合PRDX1的N端结构域（残基1-40），并利用其催化残基C152特异性切割PRDX1上K136位点的K48连接多聚泛素链，从而稳定PRDX1。OTUD6A缺失导致PRDX1降解，增强线粒体氧化应激和功能障碍，最终损害HOKs功能。尽管PRDX1已知受多种翻译后修饰调控，但本研究鉴定了一个新的PRDX1调节性DUB，并详细阐明了其去泛素化机制。目前尚无OTUD6A小分子激动剂，但HmA纳米颗粒递送系统为蛋白质治疗提供了可行策略，克服了传统贴片和凝胶在湿性口腔环境中粘附性差、滞留时间短等局限。本研究存在一定局限性，例如未使用口腔角质形成细胞特异性敲除小鼠、未探究OTUD6A在免疫细胞中的作用、H₂O₂模型不能完全模拟OU复杂微环境等，未来需进一步验证。研究结论：本研究确立了OTUD6A-PRDX1-线粒体功能障碍轴在OU病理中对HOKs稳态至关重要，首次表明OTUD6A通过去泛素化和稳定PRDX1促进HOKs迁移并抑制凋亡，从而将OTUD6A定位为口腔溃疡的一个有希望的治疗靶点。