尿石素A通过抑制氧化应激和神经炎症对缺血性卒中发挥神经保护作用

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Urolithin A Exerts Neuroprotective Effects Against Ischemic Stroke by Inhibiting Oxidative Stress and Neuroinflammation

　　

摘要：背景：缺血性卒中（IS）是主要卒中类型，通过低灌注和缺氧导致神经元损伤，造成沉重的健康负担，并以氧化应激和炎症驱动的神经功能缺损为特征。方法：通过中大脑动脉闭塞（MCAO）建立IS大鼠模型。使用神经功能评分、转棒试验、粘附去除试验、足部失误试验和Morris水迷宫（MWM）试验评估IS后的感觉运动功能和认知功能障碍。通过2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色、免疫荧光染色和蛋白质印迹法（Western blotting）评估脑损伤。为了机制探索，研究人员采用RNA转录组测序分析、免疫荧光染色和酶联免疫吸附测定（ELISA）来确定尿石素A（UA）对IS后氧化应激和神经炎症的影响。结果：尿石素A（UA）治疗被证实对缺血性卒中发挥神经保护作用，因为它可以抑制神经元损伤并改善大鼠的感觉运动和认知功能。机制上，UA上调核因子红系2相关因子2（Nrf2）/血红素加氧酶-1（HO-1）的表达，从而增强抗氧化能力，其特征为抗氧化酶（超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px））水平升高和脂质过氧化标志物丙二醛（MDA）水平降低。此外，UA抑制神经炎症，表现为促炎细胞因子（肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6））水平降低和抗炎细胞因子白细胞介素-10（IL-10）水平升高。RNA转录组测序分析进一步揭示，UA的这些神经保护作用可能与抑制病理性的核因子-κB（NF-κB）激活有关。结论：尿石素A可能通过抑制氧化应激和神经炎症对缺血性卒中发挥神经保护作用。总之，本研究为UA作为卒中后神经保护剂的临床转化提供了理论支持。

缺血性卒中（IS）是主要卒中类型，约占所有卒中病例的80%–87%，其病理核心涉及氧化应激与神经炎症的级联放大，导致不可逆的神经元损伤和严重神经功能缺损。目前临床治疗手段有限，亟需多靶点神经保护策略。尿石素A（UA）作为一种天然肠道菌群代谢产物，在神经退行性疾病模型中显示出神经保护作用，且能穿越血脑屏障（BBB），但其在IS中的作用机制尚不明确。研究人员利用大鼠中大脑动脉闭塞（MCAO）模型，系统评估了UA对IS后神经功能缺损、脑组织损伤、氧化应激和神经炎症的影响，并探讨其分子机制。研究证实UA通过激活核因子红系2相关因子2（Nrf2）/血红素加氧酶-1（HO-1）通路并抑制核因子-κB（NF-κB）信号，发挥双重抗氧化和抗炎作用，显著改善感觉运动与认知功能，减少神经元凋亡和梗死体积。该研究首次明确UA在IS中的疗效与机制，为其作为卒中后神经保护剂的临床转化提供了理论支撑。论文发表在《CNS Neuroscience》。

研究方法方面，研究人员使用成年雄性Sprague–Dawley（SD）大鼠（来自兴康生物动物中心，6–8周龄，220–250 g），通过2小时右侧MCAO后撤线建立再灌注模型。UA（溶于二甲基亚砜（DMSO）后以磷酸盐缓冲液（PBS）稀释）于再灌注后1小时经尾静脉注射（3 mg/kg）。主要技术方法包括：神经行为学评估（Garcia评分、转棒试验、粘附去除试验、足部失误试验、Morris水迷宫试验）；脑损伤评估（TTC染色、NeuN免疫荧光、Cleaved Caspase-3免疫荧光、HE染色、Western blotting）；氧化应激与炎症指标检测（ELISA测定SOD、GSH、GSH-Px、MDA及TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10）；RNA转录组测序（RNA-seq）及生物信息学分析（主成分分析、差异表达基因筛选、KEGG通路富集、蛋白-蛋白相互作用网络）。

研究结果如下：
3.1 尿石素A改善缺血性卒中后的长期神经功能：通过神经功能评分、转棒试验、粘附去除试验、足部失误试验和Morris水迷宫试验，发现在MCAO后第1至28天，UA治疗显著减轻感觉运动功能缺损（如转棒潜伏期延长、足部失误率降低、粘附去除时间缩短）和空间学习记忆障碍（逃避潜伏期缩短、目标象限停留时间及穿越次数增加）。
3.2 尿石素A减少急性梗死体积和长期组织损伤：TTC染色（3天）显示UA显著降低梗死面积百分比；乳酸脱氢酶（LDH）水平降低证实减轻脑损伤；NeuN免疫荧光（28天）显示UA减小缺血侧半球损伤区域，表明长期组织保护作用。
3.3 尿石素A抑制缺血性卒中后神经元凋亡：NeuN/Cleaved Caspase-3共免疫荧光（3天）显示UA减少皮质缺血半暗带中凋亡神经元（Cleaved Caspase-3阳性细胞减少，NeuN阳性细胞增多）；Western blotting证实Cleaved Caspase-3蛋白表达下调；HE染色显示UA改善神经元排列紊乱和空泡化；海马CA1区NeuN染色显示UA保护神经元完整性。
3.4 尿石素A改变脑转录组并抑制凋亡相关基因通路：RNA-seq分析（3天）显示UA处理使MCAO大鼠的转录组谱发生显著变化（差异表达基因3126个下调、3296个上调）；KEGG富集分析表明UA下调"凋亡"和"NF-κB信号通路"相关基因表达，提示其通过抑制这些通路发挥神经保护作用。
3.5 尿石素A可能通过Nrf2/HO-1通路抑制氧化应激：ELISA检测显示UA降低MCAO大鼠脑内MDA水平，升高SOD活性、GSH和GSH-Px水平；GO富集分析显示UA激活"细胞对氧化应激的响应"通路；热图分析显示UA上调Nfe2l2（Nrf2）、Hmox1（HO-1）、Sod2、Gpx1等抗氧化基因；蛋白-蛋白相互作用网络以Nrf2为中心节点；NeuN/Nrf2共免疫荧光显示UA促进Nrf2在神经元中的核转位；Western blotting证实UA上调Nrf2和HO-1蛋白表达。
3.6 尿石素A抑制NF-κB介导的神经炎症：ELISA检测显示UA显著降低促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平，升高抗炎细胞因子IL-10水平；RNA-seq热图显示UA抑制促炎基因（如C5ar2、Tnfrsf1a）并上调抗炎基因（如Cx3cl1）；PPI网络显示Nfkb1为连接炎症与氧化应激的枢纽；KEGG分析证实UA抑制NF-κB通路的病理激活。

讨论部分指出，本研究首次系统证实UA在MCAO模型中的神经保护作用，其机制涉及多层面协同：通过激活Nrf2/HO-1通路增强抗氧化酶活性（SOD、GSH、GSH-Px）、降低MDA，同时抑制NF-κB信号以减少促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）并增加抗炎因子（IL-10），从而减轻氧化应激和神经炎症，抑制神经元凋亡。UA具有良好的口服生物利用度和BBB通透性，支持其临床转化潜力。但研究存在局限性：未明确最佳剂量和治疗时间窗，未使用通路特异性抑制剂或基因操作直接验证因果关系，未区分微胶质细胞、星形胶质细胞等细胞类型特异性炎症反应，且未全面评估肝肾功能毒性。未来需结合临床样本、多物种验证及单细胞水平分析。

研究结论：总之，UA治疗通过抑制NF-κB信号通路激活和激活Nrf2/HO-1信号通路，发挥多靶点协同调控，减轻氧化应激和神经炎症，从而减少神经元凋亡，赋予有前景的神经保护潜力。本研究为UA在缺血性卒中中的转化应用提供了实验证据，并为开发天然小分子化合物作为卒中干预治疗策略提供了新见解和理论基础。