对菊苣来源的胚芽烷A合成酶进行半理性设计与优化，以提高酿酒酵母中(?)-β-榄香烯的产量

《BMC Biotechnology》：Semi-rational design and engineering of chicory-derived germacrene A synthase for enhanced (?)-β-elemene production in Saccharomyces cerevisiae

　　

摘要

在本研究中，我们采用半理性工程策略来提升来自菊苣的germacrene A合成酶（CiGASlo）的催化性能和操作稳定性，该酶是用于立体化学定向合成(–)-β-elemene的关键生物催化剂。首先通过置信度分析、立体化学质量评估以及与另一种植物germacrene A合成酶的结构比较，对AlphaFold2预测的模型进行了验证。随后利用分子对接技术确定了法尼基焦磷酸（FPP）附近的底物邻近残基，而丙氨酸扫描和HotSpot Wizard 3.0则被用作稳定性和突变耐受性筛选工具，而非催化活性的直接预测指标。通过对经过筛选的突变库进行实验检测，发现了多个活性提升的变异体，包括D337H、L415W、D477H、E485Y、R488A、W305A以及双变异体W305A/L415W。实验结果显示，在固定实验条件下，W305A/L415W具有最高的比活性（0.95?±?0.03 U·mg^??1，比野生型高69.6%）。进一步的特性分析表明，相比双变异体，L415W具有更优的Km值、kcat/Km值以及热稳定性参数。在工程化酵母菌株中表达W305A/L415W后，通过连续喂料方式可生产出5.44 g·L^??1的(–)-β-elemene，这证明了该菌株配置的可行性，但并未显示出其相较于含L415W的菌株具有更优优势。本研究为在微生物细胞工厂中改进植物萜烯合成酶提供了一种结合酶工程与发酵验证的策略。

图表摘要

在本研究中，我们采用半理性工程策略来提升来自菊苣的germacrene A合成酶（CiGASlo）的催化性能和操作稳定性，该酶是用于立体化学定向合成(–)-β-elemene的关键生物催化剂。首先通过置信度分析、立体化学质量评估以及与另一种植物germacrene A合成酶的结构比较，对AlphaFold2预测的模型进行了验证。随后利用分子对接技术确定了法尼基焦磷酸（FPP）附近的底物邻近残基，而丙氨酸扫描和HotSpot Wizard 3.0则被用作稳定性和突变耐受性筛选工具，而非催化活性的直接预测指标。通过对经过筛选的突变库进行实验检测，发现了多个活性提升的变异体，包括D337H、L415W、D477H、E485Y、R488A、W305A以及双变异体W305A/L415W。实验结果显示，在固定实验条件下，W305A/L415W具有最高的比活性（0.95?±?0.03 U·mg^??1，比野生型高69.6%）。进一步的特性分析表明，相比双变异体，L415W具有更优的Km值、kcat/Km值以及热稳定性参数。在工程化酵母菌株中表达W305A/L415W后，通过连续喂料方式可生产出5.44 g·L^??1的(–)-β-elemene，这证明了该菌株配置的可行性，但并未显示出其相较于含L415W的菌株具有更优优势。本研究为在微生物细胞工厂中改进植物萜烯合成酶提供了一种结合酶工程与发酵验证的策略。

图表摘要