未治疗CLL患者中可检测到EBV DNA和高亲和力抗EBV衣壳抗原抗体的循环CD19+CD5+淋巴细胞上趋化因子受体CCR2的频率增加

《Canadian Journal of Infectious Diseases and Medical Microbiology》：Increased Frequency of the Chemokine Receptor CCR2 on Circulating CD19+CD5+ Lymphocytes in Therapy-Na?ve CLL Patients With the Detectable EBV DNA and High-Avidity Antibodies Against the EBV Capsid Antigen

　　

在未治疗慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者外周血（PB）中，高EBV载量与更短的总生存期相关。研究人员先前证实，EBV（Epstein-Barr病毒）感染B细胞会上调CCR1和CCR2。在本研究的54例未治疗CLL患者中，研究人员分析了循环CD19⁺CD5⁺淋巴细胞上CCR1、CCR2和CD38的表达，测定了PB单个核细胞（PBMC）中的EBV载量（EBV DNA拷贝数）和EBV转录本（BZLF1、LMP1、LMP2A和EBNA2），并测量了抗EBV衣壳抗原IgG抗体（anti-EBV-CA-IgG）的水平和亲和力。BZLF1转录本仅在1例患者中检出；LMP1和EBNA2转录本仅在2例患者中检出，在这些患者中，呈现CCR1或CCR2的CD19⁺CD5⁺淋巴细胞的频率相对于EBV阳性组（>5个EBV DNA拷贝/10⁵个PBMC；n=21）的中位值分别升高了2.5倍、4.3倍和2.9倍，以及2.1倍、1.2倍和2.9倍。与EBV未检出组相比，EBV阳性患者中anti-EBV-CA-IgG的水平和亲和力显著更高（分别为p=0.007和p=0.018）。值得注意的是，在EBV阳性患者中，高亲和力anti-EBV-CA-IgG（相对亲和力指数RAI范围61.0–94.6）与CCR2在CD19⁺CD5⁺淋巴细胞上的频率升高2.3倍相关，而与之比较的是最高亲和力（RAI >95.0；p=0.006）的患者。在具有最高anti-EBV-CA-IgG亲和力（RAI >95.0；n=13）的患者中，这提示抗原呈递率高以及近期裂解性病毒再激活，CCR2呈递的CD19⁺CD5⁺PB淋巴细胞的频率比所有高亲和力患者（n=31；p=0.032）的中位值低1.7倍。研究人员假设，CCR2引导白血病淋巴细胞从循环系统迁移至配体丰富的淋巴器官，从而构成EBV对CLL进展的贡献。

**论文解读：EBV再激活通过上调CCR2促进CLL进展的潜在机制**

**研究背景与问题**
慢性淋巴细胞白血病（CLL）是欧美最常见的成人白血病，其临床病程具有高度异质性。EBV是一种广泛存在的γ疱疹病毒，超过90%的成年人群血清阳性。在免疫抑制的CLL患者中，EBV再激活可能加剧疾病进展。先前多项独立研究报道，CLL患者诊断时外周血（PB）中高EBV DNA载量与更短的总生存期（OS）及更具侵袭性的临床病程相关。此外，CLL患者中免疫功能障碍常见，导致感染和自身免疫并发症增加。研究人员前期工作表明，EBV体外感染健康供者B细胞可上调炎症趋化因子受体CCR1和CCR2，但CCR3或CCR5不受影响。然而，在CLL患者中，EBV再激活与趋化因子受体表达之间的关系尚不明确。本研究旨在探讨未治疗CLL患者中，可检测到的EBV DNA及EBV转录本是否与PB中CD19⁺CD5⁺淋巴细胞上CCR1、CCR2表达升高相关，以及抗EBV衣壳抗原（CA）IgG抗体亲和力是否反映近期裂解性病毒再激活，进而影响CCR2介导的白血病细胞迁移。该研究发表于《Canadian Journal of Infectious Diseases and Medical Microbiology》。

**研究开展与结论**
研究人员对54例2014–2020年间在拉脱维亚Riga East University Hospital新诊断的未治疗CLL患者进行了横断面分析。通过定量实时PCR检测PBMC中EBV DNA载量，巢式PCR检测EBV mRNA转录本（BZLF1、LMP1、LMP2A、EBNA2），流式细胞术检测PB中CD19⁺CD5⁺和CD19⁺CD5^-淋巴细胞上CCR1、CCR2和CD38的表达，ELISA检测血浆抗EBV-CA IgG水平及亲和力（相对亲和力指数RAI）。研究得出以下结论：EBV阳性患者（>5个EBV DNA拷贝/10⁵个PBMC）的抗EBV-CA IgG水平（p=0.007）和亲和力（p=0.018）显著高于EBV未检出组；高亲和力（RAI 61.0–94.6）的EBV阳性患者中，CCR2阳性CD19⁺CD5⁺淋巴细胞频率比最高亲和力（RAI >95.0）患者高出2.3倍（p=0.006）；在检测到EBV转录本（BZLF1、LMP1/EBNA2）或极高EBV载量的患者中，CCR1、CCR2和CD38表达显著升高。研究人员提出，EBV裂解再激活后，新感染的CLL细胞上调CCR2，引导其从循环迁移至富含CCR2配体（如CCL2）的淋巴器官，从而促进CLL进展。

**主要关键技术方法**
样本队列来源：54例2014–2020年于Riga East University Hospital新诊断的CLL患者（24女，30男，年龄41–88岁）。主要方法：(1) 实时定量PCR（商业试剂盒EBV Real-TM Quant）检测PBMC中EBV DNA拷贝数。(2) 巢式PCR检测PBMC中EBV mRNA（BZLF1、LMP1、LMP2A、EBNA2）的表达。(3) 七色流式细胞术分析PB淋巴细胞表面CCR1（CD191）、CCR2（CD192）、CD38及CD19、CD5的表达。(4) ELISA（Euroimmun试剂盒）定量检测血浆抗EBV-CA IgG和抗EBNA1 IgG水平，并测定抗EBV-CA IgG的RAI。(5) 统计采用Mann–Whitney U检验，p<0.05为显著。

**研究结果**
**3.1 外周血单个核细胞中EBV DNA载量及研究受试者特征**
在128例筛查患者中，47例（36.7%）检出EBV DNA。本研究纳入54例，分为EBV阳性组（n=21，>5拷贝/10⁵ PBMC）和EBV未检出组（n=33）。两组在年龄、性别、Rai分期、IGHV突变状态、ZAP70 mRNA表达等方面无显著差异，但EBV阳性组红细胞计数和血红蛋白水平显著降低，首次治疗时间（TTFT）显著缩短（p=0.015）。两组CD19⁺CD5⁺淋巴细胞上CCR1、CCR2、CD38表达无显著差异。

**3.2 循环EBV特异性抗体的水平和亲和力**
所有45例可测患者均血清阳性（抗EBV-CA IgG和抗EBNA1 IgG阳性），且抗EBV-CA IgM阴性，排除近期原发感染。EBV阳性患者抗EBV-CA IgG水平（中位244.7 vs. 188.5 RU/mL，p=0.007）和RAI（中位95.4 vs. 89.0，p=0.018）均显著高于EBV未检出组。将EBV阳性患者按RAI分层：高亲和力（RAI 61.0–94.6，n=9）与最高亲和力（RAI >95.0，n=13，含9例EBV阳性和4例EBV未检出）比较，高亲和力组CCR2阳性CD19⁺CD5⁺淋巴细胞频率（中位24.6%）比最高亲和力组（中位10.7%）高2.3倍（p=0.006）。在全部高亲和力患者（n=31，RAI 61.3–94.6）与最高亲和力患者（n=13）比较中，最高亲和力组CCR2阳性频率降低1.7倍（p=0.032），CD38阳性频率降低10.0倍（p=0.048）。

**3.3 高EBV载量及PBMC中EBV基因mRNA表达**
3例患者具有高EBV DNA载量（>200拷贝/10⁵ PBMC）。其中1例（患者No.164，258拷贝）检测到BZLF1转录本，该患者和另1例最高载量患者（No.229，523拷贝）的CD19⁺CD5⁺淋巴细胞上CCR1、CCR2、CD38表达较EBV阳性组中位值升高2.5/2.7倍、2.1/1.8倍、5.3/2.9倍。仅2例患者（No.170和No.207，6拷贝）同时检测到LMP1和EBNA2转录本，其CCR1、CCR2、CD38阳性率分别升高4.3/2.9倍、1.2/2.9倍、3.3/6.9倍。LMP2A转录本在所有患者中均未检出。

**讨论与结论**
讨论部分指出，EBV阳性患者中抗EBV-CA IgG高亲和力（RAI 61.0–94.6）与CCR2阳性CD19⁺CD5⁺淋巴细胞频率升高相关，而最高亲和力（RAI >95.0）患者中该频率降低，提示近期裂解再激活后新感染CLL细胞可能已迁移至淋巴器官。研究人员假设，在EBV裂解再激活后，EBV感染PB CLL淋巴细胞诱导CCR2表达上调，从而引导白血病细胞从循环迁移至富含CCR2配体（如CCL2）的淋巴器官，促进CLL进展。该研究还讨论了EBV潜伏期转变（如latency IIb）及免疫缺陷在其中的作用，并指出EBV靶向免疫治疗（如EBV特异性CTL、CAR-T）及裂解诱导疗法在EBV阳性恶性肿瘤中的探索。研究局限性包括样本量较小，且未纳入其他疱疹病毒（如CMV）的比较。结论翻译：研究人员假设，CCR2引导白血病淋巴细胞从循环中迁移至配体丰富的淋巴器官，从而构成EBV对CLL进展的贡献。