ANXA7在结直肠癌早期诊断与预后预测中的双重作用：血清外泌体蛋白质组学与单细胞转录组学的启示

《Journal of Nanobiotechnology》：Dual roles of ANXA7 in the early diagnosis and prognostic prediction of colorectal cancer: insights from serum exosome proteomics and single-cell transcriptomics

　　

摘要

结直肠癌是从正常黏膜经过10–15年发展成晚期腺瘤及侵袭性癌瘤；但目前仍急需能够检测癌前病变并预测患者预后的无创生物标志物。循环中的小型细胞外囊泡（sEVs，即外泌体）是纳米级的脂质双层载体，可在体液中稳定存在，因此是用于肿瘤分子特征分析的理想液体活检材料。然而，现有的大多数外泌体生物标志物研究采用二元病例对照设计，缺乏连续的腺瘤到癌瘤队列，且很少将外泌体蛋白组学与单细胞转录组学结合，以追溯这些生物标志物的细胞起源或构建诊断与预后相关的模型。我们采用了EXODUS快速sEV分离技术以及4D-DIA定量蛋白组学方法，对四组连续样本的血清外泌体蛋白组进行了分析：健康对照组、腺瘤患者、早期结直肠癌患者以及晚期结直肠癌患者。通过时间序列聚类和跨队列差异筛选，我们发现 annexin A7（ANXA7）是一种在结直肠癌恶性转化过程中持续上调的外泌体蛋白。西方印迹实验和商业ELISA检测证实了循环中sEV-ANXA7水平的逐渐上升，而组织免疫组化则进一步证明了从正常上皮到腺瘤及癌瘤上皮中ANXA7表达的增加。单次ROC曲线分析显示，血清sEV-ANXA水平在区分健康人群与患有高风险晚期腺瘤的人群时，其AUC值为0.821。将sEV-ANXA7水平与传统标志物CEA和CA199的水平相结合，显著提升了对癌前病变及早期结直肠癌的诊断准确性。通过对公开结直肠癌数据集进行单细胞转录组学分析，我们发现了一种独特的ANXA7?上皮祖细胞亚群，这类细胞包含癌前异常上皮细胞以及恶性转化潜力较高的早期恶性上皮细胞，它们在肿瘤组织中高度富集，同时具有较高的干细胞特征、更高的恶性评分，以及铁死亡和P53信号通路的激活。CellChat分析结果进一步表明，ANXA7?上皮祖细胞可通过CD8A–CEACAM5配体-受体相互作用与T细胞相互作用，从而帮助肿瘤逃避免疫监控。体外CCK-8和EdU功能实验也证实，ANXA7可显著加速HCT116和SW480结直肠癌细胞的增殖。基于ANXA7高表达的肿瘤组织与ANXA7?上皮祖细胞亚群中共同上调的基因，我们建立了一个包含12个基因的LASSO预后标志物，该标志物在预测TCGA训练队列以及独立GEO验证队列中患者的1–5年生存率方面表现优异（AUC＞0.68）。总体而言，这项多组学研究结果表明，血清外泌体ANXA7是一种具有双重功能的纳米囊泡生物标志物，可用于早期腺瘤筛查及结直肠癌的预后风险分层，同时还揭示了驱动结直肠癌恶性进展的致癌性ANXA7?上皮祖细胞群体。我们的研究为开发基于外泌体的无创液体活检策略以及针对结直肠癌的靶向治疗干预提供了理论依据和实用证据。

图形摘要

结直肠癌是从正常黏膜经过10–15年发展成晚期腺瘤及侵袭性癌瘤；但目前仍急需能够检测癌前病变并预测患者预后的无创生物标志物。循环中的小型细胞外囊泡（sEVs，即外泌体）是纳米级的脂质双层载体，可在体液中稳定存在，因此是用于肿瘤分子特征分析的理想液体活检材料。然而，现有的大多数外泌体生物标志物研究采用二元病例对照设计，缺乏连续的腺瘤到癌瘤队列，且很少将外泌体蛋白组学与单细胞转录组学结合，以追溯这些生物标志物的细胞起源或构建诊断与预后相关的模型。我们采用了EXODUS快速sEV分离技术以及4D-DIA定量蛋白组学方法，对四组连续样本的血清外泌体蛋白组进行了分析：健康对照组、腺瘤患者、早期结直肠癌患者以及晚期结直肠癌患者。通过时间序列聚类和跨队列差异筛选，我们发现 annexin A7（ANXA7）是一种在结直肠癌恶性转化过程中持续上调的外泌体蛋白。西方印迹实验和商业ELISA检测证实了循环中sEV-ANXA7水平的逐渐上升，而组织免疫组化则进一步证明了从正常上皮到腺瘤及癌瘤上皮中ANXA7表达的增加。单次ROC曲线分析显示，血清sEV-ANXA水平在区分健康人群与患有高风险晚期腺瘤的人群时，其AUC值为0.821。将sEV-ANXA7水平与传统标志物CEA和CA199的水平相结合，显著提升了对癌前病变及早期结直肠癌的诊断准确性。通过对公开结直肠癌数据集进行单细胞转录组学分析，我们发现了一种独特的ANXA7?上皮祖细胞亚群，这类细胞包含癌前异常上皮细胞以及恶性转化潜力较高的早期恶性上皮细胞，它们在肿瘤组织中高度富集，同时具有较高的干细胞特征、更高的恶性评分，以及铁死亡和P53信号通路的激活。CellChat分析结果进一步表明，ANXA7?上皮祖细胞可通过CD8A–CEACAM5配体-受体相互作用与T细胞相互作用，从而帮助肿瘤逃避免疫监控。体外CCK-8和EdU功能实验也证实，ANXA7可显著加速HCT116和SW480结直肠癌细胞的增殖。基于ANXA7高表达的肿瘤组织与ANXA7?上皮祖细胞亚群中共同上调的基因，我们建立了一个包含12个基因的LASSO预后标志物，该标志物在预测TCGA训练队列以及独立GEO验证队列中患者的1–5年生存率方面表现优异（AUC＞0.68）。总体而言，这项多组学研究结果表明，血清外泌体ANXA7是一种具有双重功能的纳米囊泡生物标志物，可用于早期腺瘤筛查及结直肠癌的预后风险分层，同时还揭示了驱动结直肠癌恶性进展的致癌性ANXA7?上皮祖细胞群体。我们的研究为开发基于外泌体的无创液体活检策略以及针对结直肠癌的靶向治疗干预提供了理论依据和实用证据。

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