多组学指导的HAMA/PLMA生物墨水整合机械支持、抗菌保护和脂质体KGN@Lipo用于软骨再生

《Materials Today Bio》：Multi-omics-guided HAMA/PLMA bioink integrating mechanical support, antibacterial protection, and liposomal kartogenin for cartilage regeneration

　　

关节软骨再生需要一种兼具可打印性、机械支持、抗菌功能和促软骨形成生物活性的生物墨水。研究人员在此开发了一种用于关节软骨再生的3D可打印透明质酸甲基丙烯酸酯/聚赖氨酸甲基丙烯酰胺（HAMA/PLMA，HP）混合水凝胶，并负载卡托根脂质体（KGN@Lipo）。整合的转录组学和代谢组学分析鉴定了与ECM（细胞外基质）相互作用和机械转导相关的HP相关特征，随后通过qRT-PCR（实时定量逆转录聚合酶链反应）验证了选定的机械敏感基因。第二次多组学比较显示，与对照组相比，KGN@Lipo@HP与减弱的炎症-分解代谢信号和基质保护性细胞状态相关。物理化学表征证实了快速光固化、可靠的打印保真度、改善的压缩性能、循环回弹性和可调的多孔结构，而脂质体负载保留了优化的机械基线。在功能上，KGN@Lipo@HP保持了高细胞相容性，显示出较低的细胞内ROS（活性氧）相关荧光，显著抑制了金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）生长，并促进了体外软骨形成，如增强的软骨基质染色和增加的COL2（II型胶原）和ACAN（聚集蛋白聚糖）表达所证明。在兔缺损模型中，与测试组相比，KGN@Lipo@HP与最广泛的软骨样基质沉积和最低的组织学评分相关。与对照组相比，处理缺损还表现出软骨形成和组织重塑的独特免疫组织化学特征。总之，这些发现支持一种基于HP的生物墨水平台，该平台整合了机械支持、抗菌保护和脂质体KGN生物活性，以支持软骨允许的再生微环境。

关节软骨损伤因其成熟组织无血管、无淋巴、细胞稀少，受损后内在再生能力有限而难以修复。现有干预措施仅能缓解症状或部分填充缺损，难以恢复具有天然基质组成、力学性能和长期稳态的耐久透明样组织。因此，研究重点从简单缺损填充转向能够稳定病灶、调控局部微环境并指导合成代谢重塑的生物材料系统。水凝胶因高含水量和类细胞外基质（ECM）网络结构，利于细胞容纳和基质沉积，结合3D打印可实现空间控制、缺损适形和可编程结构。透明质酸基质适用于软骨，但单纯透明质酸甲基丙烯酸酯（HAMA）缺乏足够机械强度和结构稳定性。软骨机械生物学研究进一步表明，有效支架应具有机械指导性而非惰性，但损伤关节微环境中机械支持不足，并伴有氧化应激、炎症信号和基质降解酶，同时植入物周围细菌污染是软骨修复中未充分解决的风险。甲基丙烯酸化聚赖氨酸材料兼具阳离子抗菌性、光固化性和3D打印兼容性。卡托根（KGN）是低分子量促软骨形成剂，但水溶性差、局部停留时间短，纳米载体可改善局部生物利用度。本研究提出两个科学问题：单一可打印生物墨水能否同时提供机械增强、抗菌保护和持续局部KGN递送，同时保持可打印性和结构性能；这些材料功能是否与软骨再生相关的系统水平细胞反应相关联。研究人员开发了HAMA/PLMA（HP）混合水凝胶并负载KGN@Lipo（KGN@Lipo@HP），通过分阶段多组学分析评估HP相关机械转导基线和终产物相关基质保护状态，随后进行配方优化、打印与理化表征、体外功能实验和兔软骨修复。该研究支持KGN@Lipo@HP作为整合机械支持、抗菌保护和KGN活性的多功能生物墨水平台，为软骨再生提供框架。论文发表在《Materials Today Bio》。

关键技术方法包括：投影式光固化3D打印制备支架（使用EFL-BP8601生物打印机，苏州永沁泉）；整合转录组学（NovaSeq测序）和代谢组学（LC-MS/MS）分析，比较对照组与HP组及对照组与KGN@Lipo@HP组，通过Reactome、KEGG和GO富集及基因-代谢物关联分析；物理化学表征（SEM、FTIR、压缩测试、循环加载、溶胀及降解）；体外细胞实验使用人骨髓间充质干细胞（hBMSCs，iCell公司，上海）；兔关节软骨缺损模型（雄性新西兰白兔，每组3只）；组织学与免疫组化评分（Wakitani和Sellers评分）。忽略试剂和具体培养步骤。

研究结果：
3.1 机械多组学分析（Mechanical multi-omics of HP）：通过整合转录组学和代谢组学分析，HP组相对于对照组表现出与ECM相互作用和机械转导相关的特征，Reactome富集显示TGF-β（转化生长因子-β）信号、透明质酸代谢、细胞因子相关通路变化；qRT-PCR验证了HP组中ITGB1、PTK2、ROCK1、YAP1、WWTR1和CCN2表达上调，表明机械转导相关转录标志物激活。
3.2 理化与机械验证（Physicochemical and mechanical validation of HP）：优化PLMA含量（10 wt%）使压缩模量提升、孔径均一性最佳；投影式光固化打印保真度高；光流变显示快速凝胶化；KGN@Lipo负载后EE（包封率）约99.02%、载药量约12.2%，释放曲线平稳；KGN@Lipo@HP保持与HP相当的压缩模量、溶胀和降解特性。
3.3 保护性多组学分析（Protective multi-omics of KGN@Lipo@HP）：KGN@Lipo@HP组相对于对照组，Reactome富集显示细胞因子、TNF受体、白细胞介素、TGF-β受体、NF-κB（核因子κB）相关通路变化；代谢组学显示氧化磷酸化、氨基酸代谢等通路改变；整体与炎性减弱和基质保护状态一致。
3.4 细胞保护与抗菌活性（Cytoprotection and antibacterial activity）：活死染色显示细胞相容性良好；KGN@Lipo@HP组显著抑制金黄色葡萄球菌生长（杀菌率>90%），且细胞内ROS荧光降低；qRT-PCR显示PCNA、CDK2、CDK4和SOX9表达上调；辅助大鼠皮肤伤口模型显示KGN@Lipo@HP组伤口面积减小。
3.5 体外软骨形成（In vitro chondrogenesis）：KGN@Lipo@HP组在21天诱导后，Safranin O和Alcian Blue染色强度最高，COL2和ACAN免疫荧光信号最强，定量分析显著高于其他组。
3.6 体内关节软骨修复（In vivo articular cartilage repair）：兔缺损模型中，KGN@Lipo@HP组H&E、Masson、Alcian Blue和Safranin O/Fast Green染色显示缺损填充和软骨样基质沉积最佳，Wakitani和Sellers评分最低；免疫组化显示COL2和SOX9表达升高，RUNX2和β-catenin表达与对照组有显著差异。

讨论部分总结：多组学分析揭示了HP相关机械转导特征和KGN@Lipo@HP相关基质保护状态，理化表征与体外实验支持了整合功能，体内修复效果良好。研究结论翻译如下：开发了一种多组学指导的HP生物墨水负载KGN@Lipo用于关节软骨再生。系统水平分析首先鉴定了hBMSCs中HP相关的机械转导和软骨合成代谢特征。后续材料表征证实了优化HP平台的可打印性、理化稳定性和机械增强，并显示KGN@Lipo负载保留了其结构和机械性能。最终KGN@Lipo@HP构建体相对于对照组与基质保护性多组学特征相关，而直接与HP比较显示KGN@Lipo模块的加入保留了支架力学并进一步增强了软骨基质形成和体内修复。总体而言，材料与生物学数据支持KGN@Lipo@HP作为整合机械支持、固有抗菌性和局部KGN生物活性的多功能生物墨水。这项工作为设计整合可制造性与微环境调控的3D打印生物墨水提供了框架。未来研究使用独立可调基质和通路特异性扰动可能进一步定义软骨再生背后的刚度特异性信号机制。