《Materials Today Bio》：Microneedle Delivery of 3D Bioprinted Tendon Stem/Progenitor Cells Microfiber-Derived Extracellular Vesicles Enhances Chronic Massive Rotator Cuff Tears Healing
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慢性巨大肩袖撕裂（CMRCT）术后修复后的高再撕裂率主要归因于未能再生天然肌腱组织。来源于大鼠肌腱干/祖细胞（rTSPCs）的细胞外囊泡（EVs）在CMRCT治疗中展现出显著的应用潜力。然而，通过传统方法（二维培养）制备的rTSPCs-EVs产量和疗效有限，严
慢性巨大肩袖撕裂（CMRCT）术后修复后的高再撕裂率主要归因于未能再生天然肌腱组织。来源于大鼠肌腱干/祖细胞（rTSPCs）的细胞外囊泡（EVs）在CMRCT治疗中展现出显著的应用潜力。然而，通过传统方法（二维培养）制备的rTSPCs-EVs产量和疗效有限，严重制约了其广泛应用。本研究提出了一种创新策略，整合三维生物打印rTSPCs微纤维来源的EVs（3D-rTSPCs-EVs）生产技术，为CMRCT引入新的治疗途径。体外比较研究表明，3D-rTSPCs-EVs在促进肌腱分化及发挥抗炎作用方面显著优于rTSPCs-EVs。同时，为克服EVs直接注射伴随的快速清除和低生物利用度问题，研究人员设计了基于甲基丙烯酰化透明质酸（HAMA）的微针（MN）支架，用于在腱-骨连接处局部递送3D-rTSPCs-EVs（3D-rTSPCs-EVs@MN）。随后，体内实验证实3D-rTSPCs-EVs@MN通过改善的组织学、影像学表现及生物力学功能，促进了富含胶原基质的天然肌腱组织再生。此外，3D-rTSPCs-EVs通过调控巨噬细胞从促炎M1表型向促愈合M2表型极化，抑制了炎症反应。因此，研究结果表明，3D生物打印rTSPCs微纤维来源的EVs显著改善了瘢痕组织形成，增强了受损肩袖的生物力学性能，为基于EVs的CMRCT高效治疗开辟了新途径。
**论文解读：基于3D生物打印rTSPCs微纤维来源细胞外囊泡的微针递送系统促进慢性巨大肩袖撕裂愈合**
**1. 研究背景与目的**
慢性巨大肩袖撕裂（CMRCT）在肩袖损伤中占相当比例，其特征为肌腱回缩、慢性炎症和进行性脂肪浸润，严重损害腱-骨愈合。修复部位的持续炎症反应促进过度的M1巨噬细胞极化和成纤维细胞积聚，导致胶原沉积紊乱和瘢痕组织形成，而非天然腱-骨界面的再生。这些病理变化损害修复肌腱的生物力学性能，并导致术后再撕裂率居高不下（关节镜修复后达11%-94%）。因此，亟需开发能够调节胶原重塑、抑制瘢痕形成从而预防术后再撕裂的再生治疗策略。
间充质干细胞（MSCs）在增强肌腱修复方面展现出巨大潜力。其中，肌腱干/祖细胞（TSPCs）作为组织特异性MSC亚型，具有肌腱、软骨和成骨分化能力，在细胞外基质（ECM）重塑和腱-骨再生中发挥重要作用。目前大量证据表明，TSPCs的再生特性主要由其分泌的细胞外囊泡（EVs）驱动，EVs已成为肌腱再生的有前景的无细胞治疗制剂。然而，TSPCs的低丰度和有限增殖能力导致EV产量不足；此外，传统二维（2D）培养系统无法充分模拟天然细胞微环境，削弱了细胞生物活性、干性维持和EV分泌效率。同时，直接注射的EVs在体内因酶降解和免疫清除而快速清除，导致在腱-骨界面停留时间短、治疗效果不足。因此，优化培养策略以提高TSPCs-EVs的治疗效果和产量，并开发有效的局部递送系统，是推动其临床转化的关键。
本研究旨在通过三维（3D）同轴生物打印技术构建高密度rTSPCs微纤维培养体系，制备功能增强的3D-rTSPCs-EVs，并将其整合入基于甲基丙烯酰化透明质酸（HAMA）的微针（MN）平台，实现对腱-骨界面（TBI）的局部持续递送，系统评估其对CMRCT的治疗效果及机制。
**2. 主要技术方法**
本研究采用3D同轴挤出生物打印技术制备rTSPCs负载的高密度微纤维，通过商业试剂盒提取并纯化EVs。采用透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒追踪分析（NTA）、蛋白质印迹（WB）及液相色谱-质谱联用（LC-MS）蛋白质组学分析对EVs进行表征。体外实验利用免疫荧光、RT-qPCR和WB评估EVs的肌腱诱导及抗炎能力。将3D-rTSPCs-EVs装载入HAMA微针构建递送系统，并通过扫描电镜（SEM）、力学测试、体外释放及活体成像评估其性能。动物实验使用48只18周龄雄性Sprague-Dawley大鼠（353±15.26 g）建立CMRCT模型，随机分为5组（Sham、CMRCT、MN、rTSPCs-EVs@MN、3D-rTSPCs-EVs@MN），样本来源于大鼠跟腱组织。通过组织学染色（H&E、Masson、番红O/固绿、天狼星红）、免疫荧光/免疫组化、Micro-CT、MRI及生物力学测试评估治疗效果。
**3. 研究结果**
**3.1 3D-rTSPCs-EVs的表征**
通过流式细胞术证实rTSPCs高表达MSC表面标志物CD29、CD44、CD90，低表达造血标志物CD45。与2D培养相比，3D培养系统显著增强了rTSPCs的增殖能力并上调肌腱相关基因（COL-I、COL-III、TNMD）表达。3D生物打印使EV产量大幅提升，每培养皿蛋白质产量提高约20倍，颗粒产量提高约98倍。TEM和NTA确认EVs呈典型杯状形态，平均粒径约126 nm。蛋白质组学分析显示，3D-rTSPCs-EVs中鉴定出315个差异表达蛋白（99个上调，216个下调），KEGG富集分析表明这些蛋白主要涉及ECM-受体相互作用、TGF-β信号和NF-κB信号通路。热图分析显示3D-rTSPCs-EVs富集了肌腱发生相关蛋白（CCN1、ITGB5、TXN、RHOA、LATS1）和抗炎调节蛋白（RGS10、MAP3K7、HSP90B2P）。细胞摄取实验表明，3D-rTSPCs-EVs被肌腱成纤维细胞摄取效率显著高于rTSPCs-EVs。
**3.2 3D-rTSPCs-EVs增强胶原沉积、肌腱诱导能力并提高胶原I/III比值（体外）**
RT-qPCR和免疫荧光分析显示，3D-rTSPCs-EVs处理显著上调肌腱成纤维细胞中Col-I、Col-III和TNMD的mRNA及蛋白表达水平。定量分析表明，3D-rTSPCs-EVs组Col-I表达增强较Col-III更为显著，导致Col-I/Col-III比值显著升高，表明其促进更成熟的肌腱样ECM表型。
**3.3 3D-rTSPCs-EVs显著抑制肌腱成纤维细胞的炎症反应**
在LPS诱导的炎症微环境中，免疫荧光和WB结果表明，3D-rTSPCs-EVs处理显著抑制促炎细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）和基质降解酶MMP9的表达，其抗炎效果显著优于常规rTSPCs-EVs。
**3.4 3D-rTSPCs-EVs@MN的合成与表征**
SEM观察显示，3D-rTSPCs-EVs@MN微针具有高度有序的阵列结构，针尖高度约800 μm，基底直径约200 μm，针间距200 μm。高倍SEM及PKH67标记证实EVs均匀分布于微针表面，粒径约100-150 nm。力学测试显示EVs装载未影响微针的机械强度。体外释放实验表明，MN系统可实现EVs长达21天的持续释放。活体成像显示，3D-rTSPCs-EVs@MN将EVs局部滞留时间延长至28天，且MN在体内28天内降解约90%，表现出良好的生物降解性。
**3.5 3D-rTSPCs-EVs@MN增强体内肩袖腱-骨再生**
在CMRCT大鼠模型中，H&E染色显示3D-rTSPCs-EVs@MN组炎症细胞浸润显著减少，腱-骨界面组织连续性改善，胶原纤维排列更规则。组织学评分证实该组肌腱成熟度评分显著高于其他修复组。番红O/固绿染色显示3D-rTSPCs-EVs@MN组异染区域显著扩大，蛋白聚糖沉积增加，表明纤维软骨再生增强。
**3.6 Micro-CT和MRI分析**
Micro-CT定量分析显示，3D-rTSPCs-EVs@MN组骨体积分数（BV/TV）、骨密度（BMD）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）均显著高于CMRCT、MN及rTSPCs-EVs@MN组，表明骨整合和矿化组织形成增强。MRI显示3D-rTSPCs-EVs@MN组肌腱信号强度降低、连续性改善、肌腱-骨界面更有序、肌腱厚度增加，提示组织成熟度提高。
**3.7 3D-rTSPCs-EVs增强修复肌腱的生物力学性能**
生物力学测试显示，3D-rTSPCs-EVs@MN组极限载荷（45.19±1.44 N）显著高于rTSPCs-EVs@MN组（30.02±1.94 N），刚度和应力也显著改善。同时，3D-rTSPCs-EVs@MN组肌腱横截面积（5.76±0.48 mm2）较MN组（7.34±0.71 mm2）和rTSPCs-EVs@MN组（8.30±0.85 mm2）显著减小，表明瘢痕相关组织肥大减轻，修复质量更高。
**3.8 3D-rTSPCs-EVs@MN促进天然且排列良好的胶原纤维形成**
Masson三色染色显示3D-rTSPCs-EVs@MN组胶原沉积显著增加，纤维排列致密且纵向平行，桥接腱-骨界面。免疫荧光和免疫组化显示，3D-rTSPCs-EVs@MN组COL-I表达增强且分布连续，COL-III表达显著降低，Col-I/Col-III比值大幅升高。天狼星红染色在偏振光下显示该组以黄-橙双折射为主，代表成熟I型胶原纤维，而CMRCT和MN组以绿色双折射为主，代表未成熟III型胶原。
**3.9 3D-rTSPCs-EVs调控巨噬细胞极化**
体外RAW264.7巨噬细胞实验显示，3D-rTSPCs-EVs处理显著降低LPS诱导的iNOS阳性（M1）比例，同时增加CD163阳性（M2）比例。体内腱-骨界面免疫荧光和免疫组化结果一致，3D-rTSPCs-EVs@MN组iNOS阳性面积最低，CD163阳性面积最高，表明其有效促进巨噬细胞向抗炎M2表型极化。
**4. 讨论与结论**
讨论部分指出，本研究的3D同轴生物打印平台模拟了肌腱各向异性微环境，支持高密度rTSPCs培养，产生的EVs富集了ECM重塑、TGF-β信号、肌腱发生和炎症调节相关蛋白，这可能是其增强生物学效应的分子基础。HAMA-MN递送系统通过微创方式实现了EVs在致密肌腱组织中的局部蓄积和长达28天的持续释放，与肌腱愈合的炎症、增殖和重塑阶段相匹配。研究证实3D-rTSPCs-EVs@MN通过促进M2巨噬细胞极化、抑制M1活化，协同增强胶原重塑、纤维软骨再生和骨整合，最终显著提升生物力学性能。研究局限性包括完全恢复肩关节功能仍具挑战、EVs在MN基质中的长期稳定性和释放动力学未直接表征、缺乏主动靶向能力、以及需要长期大动物模型验证等。
结论部分：本研究证明3D生物打印rTSPCs微纤维来源的EVs通过促进肌腱分化、胶原成熟和M2巨噬细胞极化，显著增强了CMRCT的腱-骨愈合。通过HAMA-MN递送的3D-rTSPCs-EVs@MN改善了生物力学强度，减少炎症和抑制瘢痕形成，为肩袖愈合提供了一种新策略。该研究发表于《Materials Today Bio》。
