肿瘤微环境重塑纳米组装体克服血管生成-免疫治疗耐药以增强骨肉瘤治疗

《Materials Today Bio》：Tumor microenvironment-rearranging Nanoassemblies overcome angiogenesis-immunotherapy resistance to potentiate osteosarcoma treatment

　　

传统抗血管生成癌症治疗常因适应性肿瘤缺氧及随之形成的免疫抑制微环境而疗效受限，二者共同驱动治疗耐药。为克服这一局限，研究人员构建了一种肿瘤靶向纳米平台（Reg@CeO2@HA），可共递送低剂量瑞戈非尼和具有酶活性的二氧化铈纳米颗粒。该系统可同步实现肿瘤血管正常化、清除病理性活性氧（reactive oxygen species, ROS）并缓解缺氧，从而整体重编程免疫抑制性肿瘤景观。在机制上，该平台可下调程序性死亡配体1（programmed death-ligand 1, PD-L1）表达，减少M2型肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）浸润，并减轻髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells, MDSCs）介导的T细胞耗竭。此外，它还能诱导免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death, ICD），从而启动系统性抗肿瘤免疫应答。与PD-L1阻断联合使用时，Reg@CeO2@HA可产生显著的协同疗效，表现为CD8⁺ T细胞大量浸润和肿瘤深度抑制。综上，本研究建立了同时解决肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）内血管异常和免疫功能障碍的新型治疗范式。该整合型纳米策略不仅能克服传统抗血管生成治疗的关键局限，还为骨肉瘤及其他免疫“冷”性实体瘤对免疫治疗的增敏提供了通用而强效的方法。

**论文解读：骨肉瘤微环境重塑纳米平台的研究进展**

**一、研究背景**

骨肉瘤（osteosarcoma, OS）是青少年和儿童中最常见的原发性恶性骨肿瘤，其进展高度依赖肿瘤血管生成。瑞戈非尼（regorafenib, Reg）作为多激酶抑制剂已被临床用于OS的二线抗血管生成治疗，但单药治疗往往难以改善患者生存，反而可能诱导肿瘤缺氧和免疫抑制微环境（tumor microenvironment, TME），促进药物耐受、侵袭转移及免疫治疗抵抗。骨肉瘤的免疫治疗亦未取得突破性进展，多组学研究显示其TME呈现免疫低反应状态，以M2型肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）和髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells, MDSCs）等免疫抑制细胞群为主。因此，如何重编程骨肉瘤免疫微环境、克服抗血管生成治疗的内在局限并增敏免疫治疗，成为亟待解决的关键问题。

**二、研究内容概述**

研究人员基于二氧化铈（cerium oxide, CeO2）纳米颗粒的酶模拟活性与透明质酸（hyaluronic acid, HA）的肿瘤靶向性，构建了共递送低剂量Reg的肿瘤靶向纳米平台Reg@CeO2@HA。该平台通过CeO2的过氧化氢酶样活性产氧、超氧化物歧化酶样活性清除活性氧（reactive oxygen species, ROS），并结合Reg的抗血管生成与免疫调节作用，实现肿瘤血管正常化、缺氧缓解、ROS清除及免疫微环境重塑的多重协同效应。体内外实验系统验证了该平台对骨肉瘤的抑瘤效果及免疫增敏作用，并进一步与PD-L1阻断联合评估其协同抗肿瘤疗效。该论文发表于《Materials Today Bio》。

**三、主要技术方法**

研究人员主要运用了以下关键技术方法：①基于TARGET-OS公共队列的转录组生物信息学分析（ConsensusClusterPlus无监督聚类、ESTIMATE免疫评分算法）；②纳米颗粒的合成与多维度表征（透射电子显微镜、动态光散射、傅里叶变换红外光谱、X射线光电子能谱、电感耦合等离子体质谱）；③体外细胞功能学实验（成管实验、CCK-8增殖检测、EdU掺入实验、Transwell迁移实验、流式细胞术、蛋白质免疫印迹、实时荧光定量PCR、免疫荧光染色）；④K7M2同系小鼠骨肉瘤模型的体内药效与安全性评价；⑤活体荧光成像与离体生物分布分析；⑥多色流式细胞术分析肿瘤浸润免疫细胞亚群；⑦免疫组织化学与免疫荧光组织学分析。

**四、研究结果**

**2.1 Reg在骨肉瘤条件下发挥抗血管生成和免疫激活作用**

通过TARGET-OS队列分析发现，血管生成相关评分不能独立预测骨肉瘤预后，而免疫评分高的患者总生存期显著更长，提示免疫微环境对预后的重要性。体外实验证实Reg可剂量依赖性抑制内皮细胞血管生成、增殖和迁移，并下调肿瘤细胞PD-L1表达、抑制巨噬细胞M2极化、逆转MDSCs对CD8⁺ T细胞的抑制。但体内给药后，Reg在抑制肿瘤生长和血管生成的同时，诱导缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1α, HIF-1α）上调和肿瘤缺氧，并显著增加MDSCs浸润（1.74倍），提示抗血管生成单药治疗存在缺氧驱动的免疫逃逸悖论。

**2.2 纳米颗粒的合成、表征与细胞摄取**

研究人员合成了以中空CeO2为核心、负载Reg并包被HA的纳米平台Reg@CeO2@HA-CY5.5，药物包封率为46.12%±3.42%，载药量为10.34%±2.31 wt%。表征显示该纳米颗粒呈球形、单分散，具有pH响应性药物释放（pH 5.5时48小时释放87.91%）和pH依赖性Ce³⁺/Ce⁴⁺比例转换。HA修饰显著增强了肿瘤细胞和内皮细胞对纳米颗粒的摄取。

**2.3 纳米颗粒可强效抑制血管生成并诱导肿瘤细胞免疫原性细胞死亡**

成管实验显示Reg@CeO2@HA对血管网络形成的抑制最为显著。在骨肉瘤细胞中，该纳米平台可诱导最强的钙网蛋白（calreticulin, CRT）膜转位、高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1, HMGB1）释放和ATP分泌，显著促进树突状细胞（dendritic cells, DCs）成熟，表明其兼具抗血管生成和免疫原性细胞死亡诱导功能。

**2.4 纳米颗粒通过缓解缺氧重编程免疫代谢**

缺氧条件下，纳米颗粒处理可显著下调K7M2和U2OS细胞中HIF-1α和PD-L1表达。在骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages, BMDMs）中，纳米颗粒逆转了缺氧诱导的精氨酸酶1（arginase 1, Arg1）表达和M2型标记物上调。在MDSCs中，纳米颗粒抑制缺氧诱导的诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）和Arg1表达，并恢复MDSCs抑制的CD8⁺ T细胞增殖和活化。

**2.5 纳米颗粒通过清除ROS减轻髓系免疫抑制**

纳米颗粒可有效清除M2极化BMDMs和MDSCs中的ROS，逆转IL-4诱导的Arg1表达上调，并使M2标记物CD206信号强度降至对照的7.1%。在MDSC-CD8⁺ T细胞共培养体系中，纳米颗粒处理恢复了T细胞的增殖和活化。

**2.6 纳米颗粒的体内分布与抑瘤效果**

活体成像显示HA修饰的纳米颗粒在肿瘤部位蓄积显著增强，肝脏和肠道等非靶器官分布减少。在K7M2荷瘤小鼠模型中，Reg@CeO2@HA组的终末平均肿瘤体积仅为PBS组的21.8%，且未观察到明显的全身毒性。

**2.7 纳米颗粒介导体内抑瘤效应的机制研究**

组织学分析显示，纳米颗粒处理降低了血管密度并增强CD31/α-SMA共定位，提示血管正常化；同时降低HIF-1α表达和缺氧水平，减少肿瘤内ROS。流式分析显示，Reg@CeO2@HA组M2型TAMs丰度降至PBS组的48.5%，CD4⁺ T细胞增加4.32倍，CD8⁺ T细胞增加13.4倍，成熟DCs增加2.74倍，且未引起MDSCs浸润增加。

**2.8 纳米颗粒作为PD-L1阻断的放大器产生强效抗肿瘤免疫**

联合治疗实验中，Reg@CeO2@HA与抗PD-L1联用组的平均肿瘤体积仅为PBS组的26.5%，CD8⁺ T细胞浸润较单药组进一步提高（为Reg@CeO2@HA单药组的1.59倍，抗PD-L1单药组的2.09倍），M2型TAMs进一步减少，且安全性良好。

**五、讨论与结论**

讨论部分指出，Reg@CeO2@HA作为“微环境校正器”，通过CeO2核的药物储库与催化ROS清除双重功能，以及pH依赖性Ce³⁺/Ce⁴⁺转换实现TME响应的氧释放，有效解耦了抗血管生成-缺氧-MDSC轴。相较于游离Reg，纳米制剂未加重MDSCs积聚，凸显了同步缓解缺氧的重要性。安全性方面，约90 nm核心与HA壳层降低了非靶器官蓄积和蛋白冠形成，急性与亚急性毒性评估未见显著异常，但长期滞留与慢性毒性仍需系统研究。局限性包括K7M2同系模型不能完全模拟人骨肉瘤的遗传异质性和间质复杂性，氧释放与ROS清除对免疫调节的相对贡献尚需定量解析，联合用药的最佳剂量方案与序列有待优化。

结论部分：本研究建立了一种同时解决肿瘤微环境中血管异常和免疫功能障碍的新型治疗范式。该整合型纳米策略不仅能克服传统抗血管生成治疗的关键局限，还为骨肉瘤及其他免疫“冷”性实体瘤对免疫治疗的增敏提供了通用而强效的方法。