靶向HDAC和蛋白质稳态以根除静止期癌细胞

《Cancer Gene Therapy》：Targeting HDAC and proteostasis to eradicate quiescent cancer cells

　　

化疗仍是卵巢癌（OvCa）的主要治疗手段，而化疗耐药是导致患者死亡的主要原因。细胞静止（cellular quiescence）——细胞周期可逆性退出——会增强化疗耐药性，因为化疗药物主要靶向快速增殖的细胞。在此，研究人员报告称，核小体重塑和去乙酰化酶（NuRD）复合物的组分CHD4和MBD3在静止期OvCa细胞（qOvCa）中表达下调。研究人员发现，敲低CHD4或MBD3，或使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi），均可诱导OvCa细胞进入静止状态。对HDACi处理细胞的RNA-Seq和ATAC-seq分析证实，其表达变化与静止诱导一致。此外，HDACi处理细胞显示RHO/RAC通路下调。提示RAC通路下调可能在HDACi介导的静止中发挥作用，RAC抑制剂（RACi）同样诱导了静止。HDACi和RACi均导致促增殖转录因子MRTFA从细胞核向细胞质移位，该现象已与静止相关联。对HDACi诱导的qOvCa细胞的进一步分析显示，蛋白质稳态（proteostasis）发生多种改变，包括蛋白酶体活性和自噬增强。研究人员发现qOvCa细胞依赖这些通路存活，因此HDACi与蛋白酶体抑制剂或自噬抑制剂的联合治疗可产生强烈的OvCa细胞死亡协同效应。综上，本研究支持HDACi作为诱导OvCa细胞进入静止状态并使其对靶向蛋白质稳态的药物敏感的药理学手段。

**论文解读：靶向HDAC与蛋白质稳态根除静止期卵巢癌细胞**

**研究背景与问题**
卵巢癌（OvCa）是全球致死率最高的妇科恶性肿瘤，尽管多数患者对手术和化疗初始反应良好，但约70%的患者会复发并发展为化疗耐药性疾病。化疗耐药的主要机制之一是细胞静止——细胞可逆地退出细胞周期，停止增殖，从而对主要靶向快速增殖细胞的标准化疗药物不敏感。静止期癌细胞可在适当信号下重新进入细胞周期，驱动癌症复发。因此，明确特异调控癌细胞静止的因子，有助于开发靶向治疗以预防化疗耐药。既往研究在酵母和成体干细胞中揭示了静止细胞在表观遗传、染色质重塑、核糖体生物合成、RNA加工及蛋白质翻译等方面的改变，而泛素-蛋白酶体系统（UPS）在静止维持中起关键作用。在癌症中，静止癌细胞常被视为癌症干细胞样细胞（CSCs）的一个亚群，与化疗耐药密切相关。然而，静止在卵巢癌中的具体机制尚不明确。研究人员此前通过单细胞RNA测序发现，静止期OvCa细胞中Myocardin相关转录因子A（MRTFA）/血清反应因子（SRF）通路受抑制，且表观遗传调控复合物核小体重塑和去乙酰化酶（NuRD）复合物的组分MBD3和CHD4表达下调。NuRD复合物调控细胞周期调节因子和转录因子，但它在静止中的作用尚不清楚。本研究旨在探讨NuRD复合物在卵巢癌静止诱导中的作用，并探索通过靶向蛋白质稳态根除静止期癌细胞的新策略。

**研究内容与结论**
研究人员发现，NuRD复合物组分MBD3和CHD4在静止期OvCa细胞中下调，通过基因敲低或组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）抑制NuRD复合物活性，可诱导OvCa细胞进入静止状态。RNA-Seq和ATAC-seq分析显示，HDACi处理导致RHO/RAC GTPase通路相关基因染色质闭合，RAC1抑制剂（RACi）同样诱导静止，且HDACi和RACi均导致MRTFA从细胞核向细胞质移位，从而抑制MRTFA/SRF通路。此外，HDACi诱导的静止期OvCa细胞表现出蛋白质稳态显著改变，包括蛋白酶体活性和自噬上调。这些细胞依赖这些通路存活，因此HDACi与蛋白酶体抑制剂（卡非佐米）或自噬抑制剂（氯喹）联合治疗可产生强烈的协同细胞死亡效应。在体外，联合治疗在多种卵巢癌细胞系及乳腺癌细胞系中均有效；在患者来源的类器官和共培养模型中，联合治疗显著减少肿瘤细胞活力；在皮下卵巢癌PDX小鼠模型中，HDACi与卡非佐米或丙戊酸（VPA）与氯喹的联合治疗显著延缓肿瘤生长，甚至诱导肿瘤消退。此外，研究人员通过比较酵母静止相关基因与不同诱导条件下静止期OvCa细胞的转录组，鉴定出一个跨物种和跨癌种的保守“静止核心特征”（25个基因），并在肺癌、乳腺癌细胞中验证。

**意义**
该研究揭示了NuRD复合物通过调控RHO GTPase通路和MRTFA定位来诱导卵巢癌静止的新机制，阐明了静止期癌细胞对蛋白质稳态通路的依赖性，并提出HDACi联合蛋白酶体或自噬抑制剂作为靶向静止期癌细胞的新治疗策略。该策略在临床前模型中显示出协同抗肿瘤效果，为克服化疗耐药、预防复发提供了理论基础。论文发表在《Cancer Gene Therapy》。

**关键技术方法**
1. 基因沉默：使用siRNA和shRNA敲低MBD3和CHD4。
2. 药理学抑制：使用pan-HDAC抑制剂（伏立诺他SAHA、贝利司他、丙戊酸VPA）和选择性HDAC1/2/3/11抑制剂（莫西司他），以及RAC1抑制剂（NSC 23766）、CDC42抑制剂（ML-141）、RHOA抑制剂（Rhosin hydrochloride）。
3. 转录组和表观基因组分析：对伏立诺他处理后的PT340和PT412细胞进行bulk RNA-Seq和ATAC-seq，并使用多种生物信息学工具进行差异表达、通路富集和染色质可及性分析。
4. 细胞周期分析：利用Fucci细胞周期报告系统、CellTrace Violet增殖追踪、多光谱迭代免疫荧光细胞周期图谱（28个细胞周期效应物）评估静止状态。
5. 体内模型：使用NSG小鼠皮下接种PT340卵巢癌细胞，进行药物干预并测量肿瘤体积；使用患者来源的三阴性乳腺癌类器官（IPM-BO-085和IPM-BO-139）和乳腺癌-肝细胞共培养模型。
6. 蛋白质稳态检测：荧光底物法测定蛋白酶体活性，Western blot检测自噬标志物ATG5。

**研究结果**

**1. NuRD复合物组分MBD3和CHD4在静止期OvCa中下调**
通过单细胞RNA测序发现静止期原代OvCa细胞中MBD3和CHD4 mRNA下调；Western blot证实血清饥饿诱导的静止细胞中两种蛋白水平降低。shRNA或siRNA敲低MBD3或CHD4后，细胞增殖减少，凋亡无显著变化，Fucci分析显示G0期细胞比例增加，表明MBD3/CHD4下调诱导静止。

**2. HDAC抑制剂诱导OvCa细胞进入静止状态**
四种HDACi（伏立诺他、莫西司他、贝利司他、VPA）处理48小时后，细胞数量显著减少，细胞活力几乎无影响；Fucci分析显示>90%细胞阻滞于G0期；CellTrace Violet稀释实验证实伏立诺他增加非分裂细胞比例；药物洗脱实验显示细胞周期阻滞可逆；多光谱免疫荧光细胞周期图谱显示伏立诺他处理细胞主要处于G0和pre-G0状态，p27、pRB、pS6降低。

**3. 伏立诺他诱导的静止细胞与原代静止细胞表现相似转录谱**
RNA-Seq分析显示伏立诺他处理导致5543个（PT340）和6105个（PT412）差异表达基因，4137个重叠；GO分析显示下调基因富集于核糖体生物合成、RNA加工、DNA复制、细胞周期相变等静止相关通路；RT-qPCR验证了细胞周期因子（CCNA2、CLSPN、E2F8等）和UPS因子（UBE2L6、FBXO2、PSMB9）的表达变化，与免疫荧光结果一致。

**4. HDACi调节RHO GTPase相关通路和MRTFA定位**
ATAC-seq显示HDACi处理导致RHO-GTPase（RAC1、CDC42、RHOA、RHOB）相关基因染色质关闭；RAC1抑制剂（NSC 23766）显著减少细胞数量且不显著影响活力，并增加G0期细胞比例；免疫荧光显示HDACi和RACi均导致MRTFA核定位丧失；RNA-Seq比较显示HDACi处理与MRTFA抑制剂（CCG257-081）处理细胞的转录谱高度重叠，且MRTFA抑制剂下调NuRD复合物组分，提示可能形成前馈抑制环。

**5. 鉴定核心静止特征**
将静止期OvCa细胞差异表达基因与酵母静止必需基因及有丝分裂能力必需基因重叠，筛选出25个保守基因（上调：SLC7A8、WIPI1、SERPINC2；下调：CCNF、CCNB1、HSPA14、IRAK1等）。RT-qPCR在卵巢癌、乳腺癌和肺癌细胞中验证了这些基因在不同静止诱导条件下的表达变化。

**6. 静止期OvCa细胞对蛋白质稳态通路敏感**
筛选五种蛋白质稳态干扰药物（卡非佐米、坦螺旋霉素、羟氯喹、pidnarulex、seclidemstat），单药对细胞数量影响有限，但与伏立诺他联合后，卡非佐米、羟氯喹和pidnarulex显著降低细胞活力。伏立诺他与卡非佐米联合显示强协同效应（HSA模型协同指数25-73），该效应在莫西司他和贝利司他联合卡非佐米中重现，并在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中同样有效。VPA与氯喹联合在三种OvCa细胞系中使细胞活力降低50%。机制上，伏立诺他处理增加蛋白酶体活性（荧光底物法），原代静止细胞（CTV-bright）同样表现高蛋白酶体活性；伏立诺他或血清饥饿诱导的静止细胞中自噬标志物ATG5表达上调。

**7. HDACi与蛋白质稳态抑制剂在治疗模型中协同作用**
在三阴性乳腺癌患者来源类器官（IPM-BO-085和IPM-BO-139）中，伏立诺他与卡非佐米联合使活细胞数减少85-90%；在乳腺癌-肝细胞共培养模型中，联合治疗显著减少总癌细胞数和EdU+增殖细胞数；在皮下卵巢癌PDX小鼠模型中，伏立诺他与卡非佐米联合治疗显著延缓肿瘤生长，9只小鼠中2只肿瘤不可检测，免疫组化显示联合治疗组Ki67阳性率极低且有大面积坏死；VPA与氯喹联合治疗同样延缓肿瘤生长并诱导轻度肿瘤消退。

**讨论与结论**
研究表明，NuRD复合物组分下调或抑制通过调控RHO GTPase通路和驱动MRTFA胞质定位来诱导OvCa静止。静止期OvCa细胞依赖升高的蛋白酶体活性维持存活，这成为其弱点——HDACi诱导的静止细胞在加入临床蛋白酶体抑制剂后被杀死。通过整合酵母和静止期癌细胞转录组，研究人员提出一个保守的静止核心特征，并在多种癌症类型中验证。HDACi单药在实体瘤临床试验中未导致肿瘤消退，但可能作为维持治疗延缓复发；联合化疗需注意时序（不宜在化疗前使用）。研究还发现，HDACi联合蛋白酶体抑制剂在体外和体内均产生协同效应，且该策略在乳腺癌中同样有效，提示非癌种特异性。此外，自噬抑制联合HDACi也有效。然而，研究存在局限性：大多数实验依赖广谱HDAC药理学抑制，未完全证实NuRD的特异性；体内实验仅在单一PDX模型中进行短期治疗；核心静止特征尚未进行功能验证。

**结论翻译**：
总之，本研究揭示了NuRD复合物在调控癌细胞静止中的潜在功能。通过干扰NuRD复合物活性，OvCa细胞表现出增殖率降低，但细胞活力高且在药物去除后能迅速再生长。增加的蛋白酶体活性帮助qOvCa细胞维持蛋白质稳态并在应激下存活。通过联合抑制HDAC和蛋白酶体活性，大多数OvCa细胞在体外被杀死。伏立诺他与卡非佐米的联合治疗在体内显示出显著延缓肿瘤生长的效果，提示这可能是一种针对OvCa患者的新治疗策略。