基于非靶向UHPLC-MS的代谢组学平台研究炎症细胞因子对人肾近端小管HK-2细胞的影响

《Microchemical Journal》：Untargeted UHPLC–MS-based metabolomics platform to study the effect of inflammatory cytokines on human renal proximal tubular HK-2 cells

　　

本研究旨在开发一种基于非靶向超高效液相色谱-质谱联用（UHPLC-MS）的代谢组学平台，用于研究炎症细胞因子（iCTK）对人肾近端小管HK-2细胞的影响。该平台结合了反相液相色谱-质谱（RPLC-MS）和亲水相互作用液相色谱-质谱（HILIC-MS）两种互补分析模式，并对细胞内液和细胞外液进行代谢物检测。通过多变量统计分析，研究人员发现炎症细胞因子处理可导致HK-2细胞产生显著的代谢改变，主要涉及能量代谢、氧化应激和氨基酸谱的紊乱。研究共鉴定出27种差异代谢物，为理解炎症性肾小管损伤的代谢机制提供了新的见解。这是首次将非靶向代谢组学应用于炎症细胞因子诱导的肾小管上皮细胞损伤模型。

急性肾损伤（AKI）是一种以肾功能迅速下降为特征的临床综合征，其发病机制复杂，涉及缺血、毒性损伤、炎症等多种因素。目前对AKI的诊疗手段有限，因此需要从细胞水平深入理解其病理机制。近端小管上皮细胞（PTEC）在AKI中易受损，且具有高能量代谢需求，炎症细胞因子（iCTK）被认为是导致PTEC损伤的重要介质。然而，iCTK诱导的PTEC代谢改变尚不明确。为此，该研究旨在开发一种基于超高效液相色谱-质谱联用（UHPLC-MS）的非靶向代谢组学平台，研究炎症细胞因子对人肾近端小管HK-2细胞的影响，以揭示炎症相关的代谢重编程机制。该研究由研究人员发表于《Microchemical Journal》。

研究人员以人肾近端小管上皮细胞系HK-2为模型，采用由肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-1α（IL-1α）、IL-1β和IL-2组成的iCTK混合物处理细胞24小时，模拟炎症环境。研究结合反相液相色谱-质谱（RPLC-MS）和亲水相互作用液相色谱-质谱（HILIC-MS）两种色谱模式，并在正负离子模式下对细胞内液和细胞外液进行代谢物检测。通过主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）等多元统计方法，发现iCTK处理导致HK-2细胞代谢谱发生显著变化，共鉴定出27种差异代谢物，主要涉及能量代谢、氧化应激和氨基酸代谢。

主要技术方法包括：采用Agilent 1260 LC系统耦合6530 QTOF质谱仪，使用C18和HILIC色谱柱；优化了代谢物提取方案（-20°C孵育1小时）；样本包括iCTK处理组和对照组各10个生物学重复，并设置质量控制（QC）样本；数据通过MetaboAnalyst进行多元统计分析。HK-2细胞购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。

研究结果分述如下：

**3.1 色谱条件与代谢物提取优化**：通过比较三种蛋白沉淀方法（冰上孵育5分钟、-20°C孵育1小时、干冰/冰反复冻融），选择-20°C孵育1小时作为最佳提取条件，因为该条件下提取的分子特征数最多且稳定性好。

**3.2 非靶向RPLC-MS代谢组学分析**：细胞内液在ESI+和ESI-模式下均显示iCTK组与对照组明显分离，PCA模型PERMANOVA检验p=0.001，PLS-DA模型R²＞0.93、Q²＞0.84，表明模型可靠。共提取到330个（ESI+）和151个（ESI-）分子特征，其中VIP>1.0的分别有165和71个。热图和火山图显示iCTK组中多数差异特征丰度升高。而细胞外液未获得稳健的组间区分，可能受分析漂移影响。

**3.3 非靶向HILIC-MS代谢组学分析**：细胞内液在两种电离模式下PCA均显示组间分离（PERMANOVA p<0.05），PLS-DA模型在ESI+下R²=0.87、Q²=0.64，ESI-下经四组分模型优化后R²=0.96、Q²=0.58。细胞外液在ESI+模式下有显著区分，火山图显示25个上调、35个下调特征；而ESI-模式无显著差异。

**3.4 代谢物鉴定**：对VIP>1.0的分子特征进行鉴定，共获得27种代谢物。其中，细胞内液鉴定出22种，包括肌酸、支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸）、色氨酸、焦谷氨酸、琥珀酸等；细胞外液鉴定出9种，包括黄嘌呤、泛酸、乙酰肉碱、L-肉碱等。根据代谢组学标准倡议（MSI）指南，7种为level 1（与标准品比对），20种为level 2（基于数据库和文献）。值得注意，肌酸和泛酸在iCTK组细胞内升高而细胞外降低，亮氨酸/异亮氨酸/正亮氨酸和脯氨酸在细胞内、外均降低。

**3.5 生物学意义**：讨论指出，肌酸升高可能反映肌酸激酶/磷酸肌酸系统受损或转运体SLC16A12外排减少；支链氨基酸积累可能源于其分解代谢降低，进而影响线粒体ATP生成；色氨酸升高可能提示犬尿氨酸途径活性下降，但其他代谢物未变，需进一步验证。此外，焦谷氨酸升高、次黄嘌呤和肌苷降低、黄嘌呤降低，提示氧化应激增强和嘌呤代谢异常。这些代谢改变与AKI实验模型中的观察一致。

讨论部分强调，该研究首次应用非靶向代谢组学揭示了iCTK对HK-2细胞的代谢影响，为炎症性肾小管损伤提供了代谢机制见解。但研究存在局限性：缺乏正交生物学验证、使用iCTK混合物无法区分单一细胞因子的作用。尽管如此，这些代谢改变与已知AKI病理机制相符，为后续功能研究提供了基础。

结论部分翻译：据研究人员所知，本研究首次描述了基于两种色谱和电离模式的非靶向UHPLC-MS平台，用于体外评估炎症细胞因子对HK-2细胞的影响。最佳代谢物提取方法为-20°C孵育1小时。通过PCA和PLS-DA分析，实验组间存在明显差异，并筛选出VIP>1.0的显著分子特征。热图和火山图揭示了组间代谢物丰度趋势。在细胞内水平，促炎环境与肌酸、焦谷氨酸、琥珀酸和支链氨基酸等代谢物丰度升高有关，而肌苷、脯氨酸、牛磺酸、黄嘌呤、别嘌呤醇和5'-甲硫腺苷等丰度降低。在细胞外水平，HILIC-MS检测到的代谢物变化为主。共鉴定出27种level 1或2的代谢物，它们可能与能量代谢受损（如肌酸和支链氨基酸积累）及氧化还原稳态失衡（如焦谷氨酸升高）有关。这些结果表明，iCTK暴露可能诱导PTEC发生协调的代谢重编程，为理解AKI中炎症性肾小管功能障碍的代谢机制提供了见解。