基于三元NADES：RSM-ANN-PSO优化技术的超声辅助可持续提取柚子黄酮苷方法、分子机制及环境可持续性分析

《Microchemical Journal》：Ultrasound-assisted sustainable extraction of Poncirus trifoliata flavonoid glycosides using a ternary NADES: RSM-ANN-PSO optimization, molecular mechanism and environmental sustainability

　　•一种新型的三元天然深度共晶溶剂（尿素/葡萄糖/丙酮酸），专为从三叶橘中可持续提取总黄酮糖苷而设计。•ANN-PSO集成方法能够精准优化超声辅助提取过程，其预测精度较高（R2=0.9714），优于RSM方法。•首次对基于TDES的提取过程进行全面的生命周期评估，明确了环境风险点以及实现更绿色食品加工的策略。•分子动力学与量子力学计算有助于从原子层面揭示氢键网络与溶剂化机制。•该可回收溶剂系统在三次循环后仍能保持80%以上的提取效率，有助于实现循环经济目标。

引言
三叶橘（Poncirus trifoliata，L. Raf.）是一种未被充分开发的木质植物资源，广泛分布于中国中部和东部地区[1]。这种植物在中国河南和山东两省有大量分布，两千多年来一直被用于传统医学中，其嫩果、刺和叶子具有疏肝、调和脾胃及调节胃肠功能的作用[2]。现代植物化学研究指出，黄酮糖苷，尤其是二氢黄酮糖苷，如poncirin、naringin以及相关的柑橘类黄酮，是三叶橘及其芸香科近缘物种具有药用活性的主要成分[3]、[4]，这些成分具有抗氧化、抗炎、降血糖和抗肿瘤等作用[5]。这些生物活性化合物在功能性食品和创新营养品中的应用前景广阔，因此需要开发能够保持其结构完整性和生物活性的可持续提取方法[6]、[7]。

然而，从三叶橘中提取总黄酮糖苷面临着诸多挑战。目标化合物包括亲水性糖苷和极性较低的苷元，这种结构多样性使得甲醇或乙醇等单一溶剂效果不佳，因为它们的溶解度参数很难同时适配所有目标化合物。此外，果皮的木质纤维素结构会阻碍物质传递，而糖苷键的热不稳定性则要求采用非热力方法来防止水解降解[8]、[9]。传统的石化溶剂由于挥发性高且碳足迹大，也不符合绿色化学原则[10]、[11]。虽然以ChCl为基础的二元深度共晶溶剂被广泛使用，但它们往往粘度较高，且对多组分黄酮的调控能力有限。例如，Ren等人[9]筛选了200多种基于ChCl的二元深度共晶溶剂用于处理柑橘废弃物，发现大多数溶剂的粘度超过500 mPa·s，这会减缓物质在组织中的渗透。他们的研究主要针对软果皮，并未涉及三叶橘中高木质素基质的问题，也未检测对poncirin、naringin和did的选择性。为了解决这些问题，研究人员通过添加第三种组分来调整氢键网络，从而开发出三元深度共晶溶剂[16]。Lai等人[14]使用了一种三元深度共晶溶剂来提取银杏黄酮醇糖苷，虽然降低了粘度，但仅依赖响应面方法，而该方法无法处理三元深度共晶溶剂-超声辅助提取体系中的非线性相互作用。Ran等人[33]则采用了以甘油为基础的三元深度共晶溶剂并结合ANN-GA优化方法来提取柚子皮中的naringin，但他们没有进行溶剂可回收性测试和生命周期评估。至关重要的是，此前还没有研究将完全基于生物基材料的三元深度共晶溶剂应用于三叶橘的提取。现有的大多数三元深度共晶溶剂仍然使用石油衍生的氯化胆碱作为氢键受体。此外，目前还没有一种工作流程能够同时整合智能优化、树脂耦合的溶剂回收以及针对这种木质纤维素芸香科基质中总黄酮糖苷提取的环境评估。

深度共晶溶剂最初由Abbott及其同事[12]提出，它是通过氢键受体与氢键供体之间的相互作用形成的。这类溶剂蒸气压极低，且极性可调，非常适合用于处理对热敏感的黄酮类化合物[13]、[14]、[15]。三元深度共晶溶剂通过进一步优化氢键网络来提高选择性[16]。在本研究中，我们使用尿素（氢键供体）、葡萄糖和丙酮酸（氢键受体）制备了一种生物基三元深度共晶溶剂。我们加入了20%的水，使溶剂粘度降至79.5 mPa·s，同时不会破坏溶剂化网络。将这种溶剂与超声辅助提取相结合，可形成一种协同效应明显的提取体系。声学空化作用会产生强烈的局部剪切力，从而破坏细胞壁并减少扩散边界层[17]、[18]、[19]。这一过程结合了三元深度共晶溶剂的化学可调性以及超声的机械作用，实现了较高的提取效率和选择性。由于空化的非热力特性以及深度共晶溶剂较低的蒸气压，这一提取过程对环境友好[20]、[21]。

要将这项技术转化为工业应用，精确的过程控制以及可持续性评估至关重要。虽然响应面方法较为常用，但它往往难以处理三元深度共晶溶剂-超声辅助提取体系中复杂的非线性相互作用。像ANN-PSO这样的混合方法则具备更强的建模能力，有助于确定最佳的提取条件[22]、[23]。此外，生命周期评估对于量化实际的环境负担——尤其是能源消耗和废物产生情况——非常重要，这样才能避免仅仅依靠溶剂替代这一简单说法来评判方法的优劣[24]、[25]。另外，还需要通过分子动力学和量子力学计算来揭示原子层面的溶剂化机制，从而为未来溶剂的设计提供依据[26]、[27]。基于以上考虑，本研究开发了一种新型的天然三元深度共晶溶剂，并结合超声辅助提取技术，实现了从三叶橘中高效、绿色地提取总黄酮糖苷，包括naringin、did和poncirin。我们通过单因素实验以及响应面方法和ANN-PSO算法对提取参数进行了系统优化。同时，通过大孔树脂纯化技术评估了该三元深度共晶溶剂的可回收性，而全面的生命周期评估则用于衡量整个提取过程的环境可持续性。最后，还利用分子动力学模拟和量子力学计算来阐明背后的提取机制。这项研究为绿色溶剂的设计以及从木质纤维素生物质中可持续地提取生物活性黄酮类化合物提供了理论基础。

章节摘录
通过HPLC测定三叶橘中naringin、did和poncirin的含量
三叶橘中总黄酮糖苷的含量是通过HPLC测定的，所用色谱柱为Ascentis-C18柱（250毫米×4.6毫米，5微米），检测温度为35摄氏度，流速为1毫升/分钟，进样量为20微升。为了定量总黄酮糖苷，我们建立了poncirin、naringin和did的标准曲线，同时还进行了包括稳定性、精确度、重复性和回收率测试在内的全面方法学验证（详见补充文件）。
总黄酮糖苷提取率（毫克/克）=总黄酮糖苷的质量/(poncirin + naringin + did的质量)/粗粉的质量克数
三元深度共晶溶剂的制备
三元深度共晶溶剂的合成是按照既定方法进行的。
三元深度共晶溶剂的构建
为从三叶橘中提取总黄酮糖苷，设计三元深度共晶溶剂时需兼顾溶质结构所带来的三项物理化学要求：（一）较高的氢键供体/受体密度，以便溶解极性糖苷；（二）适中的粘度，以利于超声空化作用和毛细作用渗透；（三）略偏酸性的pH值，既能破坏细胞壁结构，又不会使易水解的糖苷键发生分解。为了评估这些不同要求之间的平衡关系，我们准备了12种不同的三元深度共晶溶剂配方（比例为1:1:2摩尔比）。

结论
本研究开发了一种含水的三元深度共晶溶剂（尿素:葡萄糖:丙酮酸 = 1:2:2，含20%水），用于超声辅助提取三叶橘中的总黄酮糖苷。通过ANN-PSO算法优化得到的最佳提取参数为：处理时间35分钟，溶剂用量为33毫升/克，温度45摄氏度，功率320瓦，此时总黄酮糖苷的提取率为218.96毫克/克，相比使用50%甲醇作为提取剂时的提取率提升了33.38%。分子模拟结果显示氢键作用是主要的溶剂化机制，而经过纯化的总黄酮糖苷在体外表现出较强的抗氧化、降血糖以及抗HepG2细胞活性。

CRediT作者贡献说明
张旭祥：写作——审稿与编辑，写作——初稿撰写，资源获取，数据整理。侯一茹：写作——审稿与编辑，写作——初稿撰写，资源获取，数据整理。王志佳：形式分析。龙佳飞：实验研究。曾庆瑞：形式分析。蒋永梅：形式分析。张欣：形式分析。张玉金：形式分析。兰杰：软件操作。吴发明：资金筹集。王刚：软件操作。刘沙：项目管理。

利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢
本研究得到了贵州省现代中药创新重点实验室（黔科合平台ZSYS [2025] 019项目）、贵州省科技计划项目（黔科合基金[2024]青年项目317号）、贵州省中医药管理局科技项目（QZYY - 2025 - 020号）以及遵义医科大学中医药民族医药科学项目与博士后培训基金的支持。

张旭祥|侯一茹|王志佳|龙佳飞|曾庆瑞|蒋永梅|张欣|张玉金|兰杰|吴发明|王刚|刘沙