奈玛特韦衍生物作为优化的SARS-CoV-2抗病毒药物的探索

《ChemMedChem》：Exploration of Nirmatrelvir Derivatives as Optimized SARS-CoV-2 Antivirals

　　

奈玛特韦（Nirmatrelvir，NMV）是已批准的COVID-19治疗药物Paxlovid中的SARS-CoV-2抗病毒组分。它是一种可逆共价抑制剂，靶向SARS-CoV-2主蛋白酶（main protease，MPro），并且可被人细胞中的P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）外排。为鉴定具有改善效力和降低P-gp外排的NMV类似物，研究人员开展了一项结构-活性关系（structure–activity relationship，SAR）研究。研究人员测试了替代腈基以结合活性位点半胱氨酸的多种亲电弹头，结果表明醛基和二氯乙酰胺具有更好的酶抑制效力。MPI-136?MPro的晶体结构显示其醛基弹头与MPro活性位点Cys145形成硫代半缩醛。对多种S4结合基团的探索揭示，N端酰胺的O-to-S替换可导致更好的酶抑制效力。通过探索S2、S3和S4结合基团的不同组合，研究人员发现了两种酶抑制效力优于NMV的抑制剂。MPI-148（含有(S)-2-氮杂螺[4,5]癸烷-3-羧酸酯作为替代S2结合基团）的晶体结构显示，广泛的氢键网络将抑制剂锁定在活性位点，这解释了NMV类似物的高亲和力。对细胞中MPro结合及抗SARS-CoV-2病毒效力的进一步表征显示，在表达P-gp的细胞中，有四种抑制剂比NMV具有更强的效力。使用P-gp抑制剂CP-100356的研究表明，这些化合物对P-gp抑制的敏感性低于NMV，这与P-gp介导外排减少相一致。

SARS-CoV-2（严重急性呼吸综合征冠状病毒2型）是COVID-19的病原体。病毒进入宿主细胞后，其基因组RNA翻译出多聚蛋白pp1a/pp1ab，需经nsp3（木瓜样蛋白酶）和nsp5（主蛋白酶，MPro）水解产生非结构蛋白。MPro含有His41-Cys145催化二联体，是抗病毒药物研发的关键靶点。奈玛特韦（NMV）是已上市药物Paxlovid的组分，通过腈基弹头与MPro的Cys145形成可逆共价硫代咪酸酯，从而抑制病毒多聚蛋白加工。然而，NMV是P-糖蛋白（P-gp）多药转运蛋白的底物，在表达P-gp的细胞中会被外排，导致其细胞内浓度和抗病毒活性下降。因此，亟需开发酶抑制效力更强且不受P-gp外排影响的NMV类似物。

研究人员在《ChemMedChem》上报道了一项系统的结构-活性关系（SAR）优化研究。他们通过替换亲电弹头、修饰S4结合基团、组合不同S2/S3结合基团，获得了多个酶抑制活性和细胞抗病毒活性均优于NMV的化合物。X射线晶体学解析了关键复合物结构，揭示了S2亚口袋的构象可塑性和Cys44的潜在共价靶向位点。该研究为新一代SARS-CoV-2抗病毒药物提供了候选分子和结构基础。

主要技术方法包括：基于SAR的化合物设计合成；X射线晶体学（解析MPro与MPI-136、MPI-148复合物结构，PDB：9BQP和9BQN）；酶抑制活性测定（荧光底物法测定IC₅₀）；细胞活性测定（HEK293T细胞瞬时表达MPro-eGFP，通过细胞拯救实验测定EC₅₀）；抗病毒实验（Vero E6细胞中使用SARS-CoV-2 USA_WA1/2020株测定EC₅₀）；P-gp外排敏感性实验（使用选择性P-gp抑制剂CP-100356）；代谢稳定性实验（人肝微粒体半衰期测定）。样本来源包括HEK293T细胞、Vero E6细胞和SARS-CoV-2病毒株USA_WA1/2020。

**1. 替代亲电弹头的探索。** 将NMV的腈基分别替换为炔基（MPI-134）、二氯乙酰胺（MPI-135）和醛基（MPI-136）。酶抑制测定显示，MPI-134的IC₅₀为3.9 μM，较NMV（66 nM）降低约60倍；而MPI-135和MPI-136的IC₅₀分别为26 nM和28 nM，优于NMV。MPI-136与MPro的晶体结构表明，其醛基弹头与Cys145形成硫代半缩醛，并稳定在氧阴离子洞中。

**2. S4结合基团的优化。** 通过合成N端不同修饰的类似物（MPI-137至MPI-144），发现