《Nano Today》：Bioactive PdPt nanosheets for hypoxia modulation-enhanced radiotherapy
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摘要
随着全球癌症发病率的上升，开发有效且安全的治疗策略仍是当务之急。尽管放射治疗（RT）广泛应用于临床肿瘤学，但其治疗效果常因缺氧的肿瘤微环境诱导放射抵抗而受损。因此，缓解肿瘤缺氧以增强放射敏感性已成为改善放射治疗结局的有前景策略。在此，研究人员开发了经牛
摘要
随着全球癌症发病率的上升，开发有效且安全的治疗策略仍是当务之急。尽管放射治疗（RT）广泛应用于临床肿瘤学，但其治疗效果常因缺氧的肿瘤微环境诱导放射抵抗而受损。因此，缓解肿瘤缺氧以增强放射敏感性已成为改善放射治疗结局的有前景策略。在此，研究人员开发了经牛血清白蛋白（BSA）修饰的具有内在催化活性、放射增敏能力和光热特性的PdPt纳米片（PdPt@BSA），用于增强癌症治疗。PdPt@BSA有效放大X射线诱导的细胞损伤，表现为活性氧（ROS）生成增加、线粒体功能障碍加重和DNA双链断裂增强。值得注意的是，PdPt@BSA通过催化产氧缓解了肿瘤缺氧，并伴随缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的下调，从而克服缺氧诱导的放射抵抗，显著增强放射治疗的治疗效果。此外，PdPt@BSA表现出强近红外吸收和出色的光热转换效率，在近红外照射下进一步增强了肿瘤放射增敏效果。体内研究表明，基于PdPt@BSA的联合治疗显著抑制肿瘤生长，且全身毒性极小。此外，PdPt@BSA部分诱导免疫原性细胞死亡，提示其具有激活抗肿瘤免疫应答的潜力。总体而言，本研究提出了一种基于PdPt纳米片的多功能纳米平台，整合了催化缺氧调控、放射增敏和光热增强功能，为改善癌症放射治疗提供了一种有前景的策略。
论文解读：PdPt@BSA纳米片通过缺氧调控增强放射治疗的研究
一、研究背景与问题提出
放射治疗（radiotherapy, RT）是临床肿瘤学中应用最广泛的治疗手段之一，约50%–70%的癌症患者接受放射治疗。然而，其疗效高度依赖于肿瘤的氧合状态。缺氧的肿瘤微环境显著降低放射治疗诱导的DNA损伤，导致内在的放射抵抗。更重要的是，放射治疗可能对周围正常组织造成非特异性损伤，从而限制了临床实践中放射剂量的进一步升级。肿瘤血管异常、代谢失调和缺氧共同限制了通过剂量升级来进一步改善放射治疗疗效的可能性。因此，增强肿瘤放射敏感性已成为改善放射治疗结局的关键策略。
光热治疗（photothermal therapy, PTT）利用光热剂将近红外（near-infrared, NIR）光转化为热量以实现肿瘤消融。尽管PTT具有空间可控性和微创性等优势，但其临床转化受到组织穿透力差、光热效率欠佳以及难以维持热疗效果的限制。因此，PTT更适合作为辅助手段而非独立的治疗方案。
随着纳米技术的快速发展，基于纳米材料的癌症治疗引起了广泛关注。纳米材料不仅可作为高效的药物载体，还可作为肿瘤微环境调控和治疗增敏的多功能平台。其中，贵金属纳米材料如Au、Pd、Pt及其合金，因其高原子序数、优异的化学稳定性和独特的电子结构而成为有前景的放射增敏剂。特别是贵金属异质结构纳米片，具有可调的电子构型和丰富的表面活性位点，在催化反应和辐射增强方面展现出强大潜力。此外，其固有的理化性质可贡献辅助光热效应，进一步改善治疗性能。
PdPt纳米片作为一类二维双金属纳米材料，因其催化和生物医学应用而备受关注。作为双金属体系，PdPt纳米片整合了Pd的催化性能与Pt的高原子序数（Z = 78），从而增强放射治疗过程中X射线的吸收和能量沉积，促进ROS生成。Pd的引入可调控Pt的电子结构，从而增强过氧化氢酶样活性，促进肿瘤微环境中内源性过氧化氢分解为氧气。这一过程有效缓解肿瘤缺氧，提高放射敏感性。此外，PdPt纳米片表现出适度的近红外吸收，可提供辅助光热效应，进一步增强治疗增敏效果。
近年来，将放射治疗与辅助治疗手段相结合的联合策略已被探索用于改善实体瘤的治疗结局。温和的光热效应已被报道可改善肿瘤灌注和氧合，从而增强放射敏感性。此外，放射治疗诱导的肿瘤损伤可促进免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death, ICD），引发抗肿瘤免疫应答并改善联合治疗的疗效。然而，免疫抑制和缺氧的肿瘤微环境仍限制着治疗效果。利用BSA等生物相容性分子进行表面功能化可提高纳米颗粒的稳定性、生物相容性和细胞摄取效率，从而增强体内性能。
基于上述考虑，研究人员开发了BSA功能化的PdPt异质结构纳米片（即PdPt@BSA），整合催化和放射增敏能力，用于增强黑色素瘤治疗。
二、主要技术方法
本研究采用多学科交叉的技术手段。首先，通过CO辅助还原法合成约13 nm的Pd纳米片种子，再通过种子生长法制备约50 nm的Pd纳米片，随后以Pd纳米片为模板，在还原剂存在下将氯铂酸还原沉积于Pd纳米片表面，制备PdPt纳米片，并通过BSA表面修饰获得PdPt@BSA。材料表征方面，采用透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）、X射线衍射（X-ray diffraction, XRD）、动态光散射（dynamic light scattering, DLS）等手段对纳米片的形貌、晶体结构和水合粒径进行表征。光热性能通过808 nm近红外激光照射下的升温曲线和光热转换效率计算评估。体外实验中，利用CCK-8实验评估细胞活力，克隆形成实验评估放射增敏效果，采用DCFH-DA、MitoSOX、JC-1等荧光探针检测细胞内ROS、线粒体超氧化物和线粒体膜电位，通过γ-H2AX免疫荧光染色评估DNA双链断裂，利用Western blot检测HIF-1α和cGAS-STING通路蛋白表达，通过流式细胞术和ICP-MS定量细胞摄取，以3D肿瘤球模型评估肿瘤穿透能力，并采用骨髓来源树突状细胞（bone marrow-derived dendritic cells, BMDCs）共培养体系评估吞噬和成熟。体内实验中，采用B16-F10黑色素瘤皮下移植瘤模型（雌性C57BL/6小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司），通过瘤内注射给药，结合808 nm激光照射和/或X射线照射，评估肿瘤生长抑制效果，并通过免疫荧光染色检测肿瘤组织中γ-H2AX、HIF-1α、CRT、HMGB1、CD4和CD8的表达。
三、研究结果
（一）PdPt纳米片的合成、理化表征及催化性能
TEM显示所制备的PdPt纳米片形貌相对均匀，平均横向尺寸为62.8 nm。高倍TEM图像显示大量Pt纳米颗粒均匀装饰在纳米片表面。SAED和XRD结果证实了纳米片的多晶性质，所有衍射峰均可指标化为Pd（JCPDS No. 46–1043）和Pt（JCPDS No. 04–0802）的特征晶相。HRTEM显示晶格间距为0.226 nm和0.137 nm，分别对应Pd（220）和Pt（111）晶面。元素mapping显示Pd和Pt均匀分布。DLS分析显示PdPt纳米片的平均水合粒径为100.15 ± 1.35 nm，多分散指数（PDI）为0.259 ± 0.010。BSA修饰后，zeta电位从?17.16 ± 4.97 mV显著降至?66.18 ± 3.40 mV，证实BSA功能化成功。紫外-可见光谱显示纳米片在300–900 nm范围内具有宽谱吸收，覆盖可见光和近红外区域。催化性能评估显示，PdPt纳米片加入含H?O?溶液后迅速产生大量气泡，且气泡量随浓度增加而增加，表明其具有高效且浓度依赖的过氧化氢酶样活性，可催化H?O?分解为O?和H?O。Western blot分析显示，PdPt纳米片处理浓度依赖性地显著下调HIF-1α表达，同时氧敏感探针[Ru(dpp)?]Cl?荧光强度显著降低，证实细胞内氧水平升高。
（二）PdPt纳米片的光热性能
在808 nm近红外激光照射下，PdPt纳米片悬浮液表现出快速的温度升高，且升温幅度与纳米片浓度和照射时间正相关。当浓度从12.5 μg/mL增加到100 μg/mL时，最高温度从29.4 °C升至67.7 °C。在50 μg/mL的代表浓度下，ΔT达到31.1 °C。根据升降温曲线计算，PdPt纳米片的光热转换效率（η）为59.42%，显著高于金纳米棒（GNR，η = 21%）、FeSH NPs（η = 28.1%）、MHB-HA NPs（η = 30.37%）和PVP-AuPt NRs（η = 35.95%）。五次加热-冷却循环实验表明，最高温度几乎保持不变，升降温曲线几乎完全重叠，证实了优异的光热稳定性。体外光热治疗实验显示，PdPt纳米片联合808 nm激光照射10 min可诱导浓度依赖性细胞死亡，在25 μg/mL浓度下约50%的细胞被消除。
（三）体外放射-光热治疗性能及细胞机制
在B16-F10黑色素瘤细胞中系统比较了未修饰PdPt纳米片、PdPt@PVP和PdPt@BSA的治疗性能。γ-H2AX染色显示，PdPt@BSA诱导的DNA双链断裂显著多于PdPt纳米片和PdPt@PVP，且荧光强度随时间增加。DCFH-DA染色显示PdPt@BSA组产生最强的ROS荧光信号。MitoSOX染色显示PdPt@BSA组线粒体超氧化物水平显著升高，JC-1染色显示线粒体膜电位显著降低，表明线粒体功能障碍和线粒体依赖性凋亡通路的激活。克隆形成实验显示，PdPt纳米片单独处理或NIR激光单独照射对克隆存活仅产生有限抑制作用，而PdPt纳米片、NIR照射和X射线照射的三联组合显著抑制克隆形成。在0–6 Gy剂量范围内，PdPt@BSA在所有照射剂量下均比未修饰PdPt纳米片产生更少的存活克隆。线性二次模型拟合得出PdPt@BSA的增敏比（SER）为1.542，显著高于PdPt纳米片的1.262。细胞摄取分析显示，PdPt@BSA-Cy3的荧光强度显著高于PdPt-Cy3和PdPt@PVP-Cy3，ICP-MS分析也证实PdPt@BSA组的细胞内Pd和Pt含量显著高于其他两组。亚细胞定位显示，内化的纳米片主要定位于溶酶体，部分逃逸至线粒体和内质网。3D肿瘤球实验显示，PdPt@BSA处理组的PI阳性细胞显著增加，表明其能有效穿透多细胞肿瘤结构并保持杀伤活性。
（四）PdPt@BSA介导的光热-放射治疗诱导免疫原性细胞死亡并激活STING-TBK1-IRF3通路促进DC成熟
Western blot分析显示，PdPt@BSA联合NIR和X射线照射显著增加p-STING、p-TBK1和p-IRF3的表达，而单独处理组仅引起微小变化，表明STING–TBK1–IRF3信号级联被强烈激活。免疫荧光染色显示，联合处理后IRF3荧光强度显著增加并发生明显的核转位，进一步证实STING通路的激活。ICD标志物检测显示，联合处理后HMGB1从细胞核释放至细胞外空间，CRT在细胞膜上的暴露显著增加，细胞外ATP分泌显著升高，ELISA进一步证实细胞外HMGB1分泌显著增加。BMDC吞噬实验显示，联合处理组的Hoechst 33342标记肿瘤细胞与CMFDA标记BMDC之间的共定位显著增加，表明BMDC对凋亡肿瘤细胞的吞噬显著增强。流式细胞术分析显示，对照组CD80?CD86? BMDC比例为21.7%，PdPt@BSA单独处理组为22.3%，NIR和X射线联合处理组为29.7%，而PdPt@BSA联合NIR和X射线处理组显著提高至40.8%，表明PdPt@BSA介导的光热-放射治疗显著促进BMDC成熟。
（五）PdPt@BSA在B16-F10黑色素瘤模型中的光热-放射治疗
在B16-F10皮下黑色素瘤模型中，当肿瘤体积达约80–100 mm3时，小鼠被随机分为八组。PdPt@BSA通过瘤内注射给药（10 mg/kg），随后根据治疗方案进行808 nm激光照射（0.4 W/cm2，8 min）和/或6 Gy X射线照射。红外热成像显示，NIR照射8 min后，对照组肿瘤温度从37.1 °C升至41.6 °C（升高4.5 °C），而PdPt@BSA处理组从38.5 °C升至51.4 °C（升高12.9 °C），证实PdPt@BSA在体内具有有效的光热转换能力。肿瘤生长曲线显示，X射线单独照射或NIR单独照射仅中度抑制肿瘤生长，PdPt@BSA单独处理无显著治疗效果。PdPt@BSA联合NIR照射或X射线照射显著延缓肿瘤生长，而PdPt@BSA介导的光热-放射治疗（G8组）几乎完全抑制肿瘤生长，肿瘤体积在整个治疗期间保持接近初始水平，终点肿瘤重量为所有组中最低。治疗期间小鼠体重稳定，无明显毒性迹象。Ki67免疫荧光染色显示，G8组Ki67表达几乎完全被抑制，表明肿瘤细胞增殖被有效抑制。H&E染色显示所有组的主要器官均无明显组织损伤，表明PdPt@BSA具有良好的生物相容性。
肿瘤组织免疫荧光分析显示，X射线单独照射诱导中等程度的γ-H2AX表达，而PdPt@BSA显著放大X射线诱导的DNA损伤，G8组γ-H2AX表达最强。HIF-1α染色显示，对照组和单独治疗组中HIF-1α高表达，而PdPt@BSA处理组信号显著降低，表明肿瘤缺氧微环境得到缓解。ICD标志物检测显示，联合治疗组的CRT暴露和HMGB1释放显著高于单独治疗组。CD4和CD8 T细胞分析显示，肿瘤组织内T细胞浸润有限，而淋巴结中T细胞数量显著增加，G8组淋巴结中CD4?和CD8? T细胞表达最强，表明联合治疗诱导了全身免疫激活。然而，肿瘤组织内T细胞浸润仍相对较弱，提示免疫抑制性肿瘤微环境仍对T细胞浸润构成障碍。
四、讨论与结论
讨论部分指出，PdPt@BSA的优异治疗功效源于光热转换、放射增敏和肿瘤微环境调控的协同整合。二维纳米片结构提供了大的可及表面积和高效的光捕获能力，有利于近红外照射下快速稳定的光热转换。高光热转换效率可能与Pd和Pt之间的电子相互作用有关，这种相互作用促进了非辐射能量耗散。除直接热消融外，光热效应还有助于改善肿瘤灌注，从而部分缓解缺氧条件。PdPt@BSA的另一个关键贡献在于通过催化产氧调控肿瘤缺氧。观察到的HIF-1α在细胞和肿瘤水平的表达下调证实了缺氧缓解的有效性。这一过程归因于肿瘤微环境中内源性H?O?催化分解为O?，增加了氧的可及性，从而增强了辐射诱导DNA损伤的氧依赖性固定。BSA表面功能化进一步改善了PdPt纳米片的生物学性能，与未修饰和PVP修饰的对应物相比，PdPt@BSA具有更高的细胞摄取和肿瘤蓄积，这主要归因于改善的胶体稳定性和增强的生物界面相容性。在直接细胞毒效应之外，PdPt@BSA介导的治疗诱导免疫原性细胞死亡，表现为CRT暴露、HMGB1释放和ATP分泌，这些损伤相关分子模式促进树突状细胞活化和抗原呈递，从而将肿瘤细胞破坏与先天免疫激活联系起来。cGAS–STING信号通路的激活进一步支持了胞质DNA感知在启动抗肿瘤免疫应答中的作用。然而，尽管诱导了全身免疫激活，但肿瘤组织内仅观察到有限的T细胞浸润，而肿瘤引流淋巴结中检测到更明显的T细胞扩增，提示免疫抑制性肿瘤微环境仍可能限制T细胞有效浸润至肿瘤部位。这种免疫排斥现象在实体瘤中常见，与物理基质屏障、抑制性细胞因子和趋化因子介导的T细胞隔离有关。
结论部分总结道，BSA修饰的PdPt纳米片（即PdPt@BSA）被开发为一种具有高效光热转换和良好胶体稳定性的多功能纳米平台，用于增强癌症治疗。整合的光热和放射增敏效应能够实现强效的肿瘤生长抑制，同时改善联合治疗条件下的治疗反应。在直接肿瘤消融之外，PdPt@BSA还通过缓解缺氧和触发免疫原性细胞死亡来调控肿瘤微环境，从而将局部治疗效果与全身免疫激活联系起来。尽管瘤内T细胞浸润仍然有限，但淋巴器官中增强的免疫应答表明该系统具有进一步免疫治疗增强的潜力。总体而言，这项工作突出了贵金属异质结构纳米片作为光热-放射治疗有效平台的潜力，并为开发面向改善癌症治疗结局的多功能纳米材料提供了合理的设计策略。该论文发表在《Nano Today》。
