高度稀释制剂中纳米颗粒的物理化学表征及N-of-1研究中的探索性血浆蛋白质组学相关性

《Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine》：Physicochemical characterization of nanoparticles in highly diluted preparations and exploratory plasma proteomic correlates in an N-of-1 study

　　

高度稀释顺势疗法制剂的物理化学性质仍未得到充分表征。本研究调查了Kali carbonicum（K₂CO₃）在50-millesimal效力（LM4–LM7，每步约1:50,000稀释）中的颗粒特征，并在安慰剂对照的N-of-1试验中探索了血浆蛋白质组学变化。扫描电子显微镜（SEM）显示，在描述性比较中，Kali carbonicum在LM4的颗粒尺寸（67.3 nm）大于乳糖对照（47.5 nm）。动态光散射（DLS）显示，在考虑小瓶水平聚类后，Kali carbonicum、乳糖对照和溶剂空白之间的尺寸、多分散性（PDI）或zeta电位无显著差异。原子力显微镜（AFM）显示，Kali中的树枝状聚集体比乳糖对照更紧凑，表明研磨影响自组织。LM7的拉曼光谱检测到对照组中不存在的碳酸盐相关谱带。血浆蛋白质组学在Kali暴露期间鉴定出6个FDR（错误发现率）显著的蛋白质，包括S100A9升高，以及炎症、细胞骨架和运动性术语的探索性富集。这些发现是探索性的，并不暗示因果关系。

**论文解读**

**研究背景与问题**

在纳米医学领域，高度稀释的顺势疗法制剂中纳米结构（包括纳米颗粒、纳米气泡和纳米结构聚集体）的存在已被多种分析技术（如透射电子显微镜、动态光散射、原子力显微镜和光谱学）所报道。这些观察引起了人们对这类系统物理化学性质的关注，并提出了在稀释过程中通过震荡驱动的界面积累机制，组织结构化材料特征可能持续存在的可能性。然而，这些结构的物理化学性质、重现性以及生物学相关性仍不清楚。纳米材料和胶体科学的概念提供了一个框架，用于检验研磨、稀释和震荡是否会产生具有与生物相互作用相关的性质的结构，包括可检测的材料特征和相关的生物反应。在纳米医学的其他领域（如诊断成像中使用的造影剂纳米颗粒），纳米颗粒的物理化学性质（如尺寸和表面化学）对临床和生物学行为的依赖性已得到充分证实。

**研究目的与意义**

为了解决这一研究空白，需要将物理化学表征与生物信息学读数相结合。本研究在N-of-1设计（一种单患者随机、双盲、安慰剂对照的多重交叉研究）中，将高度稀释制剂的物理化学分析与血浆蛋白质组学分析相结合，旨在探索Kali carbonicum（K₂CO₃）的50-millesimal（LM）效力（每步对应1:50,000稀释）中是否存在可检测的纳米和微米尺度结构特征，并评估治疗期与安慰剂期之间血浆蛋白质组学的探索性差异。该研究发表在《Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine》期刊上，为理解高度稀释制剂的材料特征及其与系统分子变化的关联提供了初步数据。

**主要技术方法**

研究人员采用以下关键技术方法开展研究：1）动态光散射（DLS），用于测量颗粒尺寸分布、多分散性指数（PDI）和zeta电位，采用线性混合效应模型分析小瓶水平聚类；2）扫描电子显微镜（SEM），用于观察颗粒形态并进行描述性尺寸比较；3）原子力显微镜（AFM），用于分析表面形貌和纳米结构自组织；4）拉曼光谱，用于检测化学键振动特征；5）血浆蛋白质组学，采用无标记数据非依赖采集（DIA）工作流程，结合质谱分析，对来自巴西塞阿拉联邦大学沃尔特·坎蒂迪奥大学医院的一名患者的血浆样本进行蛋白质鉴定和定量。样本队列来源为单患者N-of-1试验，该患者被诊断为重度抑郁发作，经开放标签治疗后达到≥50%的贝克抑郁量表-II（BDI-II）评分改善并维持≥4周。

**研究结果**

**1. 动态光散射（DLS）与扫描电子显微镜（SEM）**
DLS测量显示，在纳入小瓶作为随机截距的线性混合效应模型中，Kali carbonicum（LM4–LM7）、乳糖对照和30%水醇溶液（HAS）之间的流体动力学尺寸、PDI和zeta电位均无统计学显著差异。方差分解表明，尺寸和PDI的瓶间变异占比较小（组内相关系数约0.04–0.05），而zeta电位的瓶间变异占比显著（组内相关系数约0.39–0.42），表明制备间变异是该参数的一个相关变异来源。SEM成像显示，在描述性比较中，Kali carbonicum LM4的平均核心颗粒尺寸（67.3±10.9 nm）大于乳糖对照（47.5±10.0 nm），但仅对单个样本进行成像，该结果应视为描述性而非推断性。

**2. 液滴蒸发法（DEM）与暗场显微镜**
通过暗场显微镜观察蒸发液滴，Kali carbonicum和乳糖对照在LM4–LM7均显示径向晶体生长模式，具有树枝状和玫瑰花状形态，以及异质性分布的成核中心。两者均表现出与蒸发自组织过程一致的树枝状和径向结晶模式。

**3. 原子力显微镜（AFM）与拉曼光谱分析**
AFM形貌分析显示，乳糖对照在LM4呈现密集细颗粒聚集体，随稀释度增加（LM5–LM7）垂直起伏和结构复杂性逐步增加，LM7形成开放低密度分支结构。相比之下，Kali carbonicum表现出不同的形貌演化：LM4呈球状形态，最大高度（780.0 nm）高于对照；随后呈非线性进展，在LM7形成高度有序的树枝状结构（最大高度1.1 μm）。拉曼光谱在Kali carbonicum LM7中检测到与纯K₂CO₃原料参考光谱一致的四个碳酸盐相关振动带（ν1对称伸缩、ν2面外弯曲、ν3反对称伸缩、ν4面内弯曲），而水醇溶液和乳糖对照均未显示这些特征。

**4. N-of-1试验**
患者为一名46岁女性，抑郁症状在开放标签导入期显著改善（BDI从32降至1），随后进入N-of-1试验。在交替服用Kali carbonicum和安慰剂的模块中，患者临床状态保持稳定：BDI评分在0–2之间波动（均值0.63，标准差0.74），心理健康分量表（MCS-12）和生理健康分量表（PCS-12）评分均处于稳定范围。Kali与安慰剂治疗期之间的临床结局（BDI、MCS-12、PCS-12、临床总体印象-严重度量表CGI-S）无显著差异。

**5. 血浆蛋白质组学分析**
通过质谱分析鉴定出343种蛋白质，经质量控制（FDR≤1%）后，对217种蛋白质进行差异检验。经Benjamini-Hochberg校正后，6种蛋白质在Kali治疗期与安慰剂期之间表现出显著差异：S100A9升高（log2FC=1.41，q=0.0139），MAGEC3、BPIFA4P、DNAH8、ADIPOQ和KRT13降低（log2FC分别为-2.37、-1.76、-1.66、-1.55、-1.24，均q<0.05）。功能富集分析（基于FDR校正的蛋白质列表）显示，基因本体（GO）术语中至少有两个重叠蛋白质支持的类别包括有机/羧酸结合、炎症反应调控、细胞骨架组织、细胞运动性、凋亡/程序性细胞死亡的正调控以及上皮细胞分化。非GO富集结果（如DisGeNET疾病注释、Reactome通路和蛋白质组药物图谱）由于输入蛋白质列表较小，主要基于单蛋白质重叠，应视为探索性描述。

**总结讨论与结论**

讨论部分指出，该研究不能建立Kali carbonicum制剂的物理化学特征与治疗期间血浆蛋白质组学变化之间的因果关系。尽管采用了安慰剂对照，但N-of-1试验无法排除自然时间波动对蛋白质组学变异的贡献。研究结果仅为探索性、假设生成的关联，而非证明纳米结构暴露与系统分子变化之间生物学机制的证据。然而，结合物理化学和蛋白质组学数据，该研究提供了LM制剂在交叉设计中的材料特征和分子相关性的描述性视图。物理化学分析识别出颗粒组织和碳酸盐相关光谱特征，而校正后的蛋白质组学分析发现Kali治疗期存在6种血浆蛋白差异，支持进一步研究高稀释药物制备过程中产生的物理化学特征及其在N-of-1试验中的分子相关性，而不暗示治疗效果。

**研究结论翻译**：该研究无法建立Kali carbonicum制剂的物理化学特征与治疗期间血浆蛋白质组学变化之间的因果关系。尽管采用了安慰剂对照，但N-of-1试验无法排除自然时间波动可能对观察到的蛋白质组学变异产生的影响。研究结果仅为探索性、假设生成的相关性，而非证明纳米结构暴露与系统分子变化之间生物学机制的证据。尽管如此，结合物理化学和蛋白质组学数据，该研究描述了LM制剂在交叉设计中的材料特征和分子相关性。物理化学分析识别出颗粒组织和碳酸盐相关光谱特征，而校正后的蛋白质组学分析发现Kali治疗期存在6种血浆蛋白差异，支持进一步研究高稀释药物制备过程中产生的物理化学特征及其在N-of-1试验中的分子相关性，而不暗示治疗效果。