在热诱导大肠杆菌中生产重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子：通过溶解氧调控包涵体结构与蛋白质产量

《Journal of Chemical Technology & Biotechnology》：Production of recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in thermoinducible E. coli: Tuning inclusion body architecture and protein yield via dissolved oxygen control

　　

背景：重组蛋白在大肠杆菌中的表达常导致包涵体（IBs）形成，虽能提供高蛋白积累，但通常需要额外步骤回收功能蛋白。尽管培养条件强烈影响IB的物理化学和结构特性，但在工业上广泛使用的热诱导表达系统中，溶解氧张力（DOT）的影响仍知之甚少。
结果：研究人员使用热诱导λpL-cI857系统在大肠杆菌中生产重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rHuGM-CSF）。诱导后DOT显著影响重组rHuGM-CSF的产量、IB大小及结构特性。与30%和70% DOT培养物相比，维持在低DOT（5–10%）的培养物表现出最高的体积和比蛋白产量，尽管比生长速率较低。低DOT还产生更大的IB，其类淀粉样含量降低，对蛋白水解降解和部分溶解的敏感性增加，表明聚集体结构更不紧密。相反，较高DOT（30–70%）有利于早期诱导后快速积累，但产生更小、更刚性的IB，对溶解和蛋白水解的抵抗性增强。
结论：诱导后DOT是调控IB形态、聚集状态和重组蛋白产量的有效过程参数，为改善热诱导大肠杆菌生物过程中重组蛋白下游回收提供了实用策略。? 2026 The Author(s). Journal of Chemical Technology and Biotechnology published by John Wiley & Sons Ltd on behalf of Society of Chemical Industry (SCI).

**研究背景、问题与意义**
生物制药在全球医药市场中占据重要地位，每年批准的重组蛋白（RP）药物数量持续增长。大肠杆菌因生长迅速、产量高、遗传背景清晰、操作简便且成本低廉，成为约25-30%获批生物制药的生产宿主。人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（HuGM-CSF）是一种糖蛋白，由144个氨基酸组成，含二硫键和糖基化位点，分子量14-35 kDa，可促进中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞的发育。重组HuGM-CSF（rHuGM-CSF，即莫格司亭）用于治疗中性粒细胞减少症、作为癌症免疫刺激剂和疫苗佐剂。自1991年开发以来，其工业生产主要依赖大肠杆菌包涵体（IBs）途径，随后需经溶解、复性和纯化。

大肠杆菌的λpL/pR-cI857温度诱导系统通过调控噬菌体λ的热敏突变体cI857阻遏蛋白，在低于37°C时抑制异源基因转录，高于37°C时释放抑制，从而启动重组蛋白表达。该系统无需昂贵的化学诱导剂，可减少操作污染，适合工业生物过程。然而，高温诱导伴随的高合成速率和胁迫条件易导致蛋白质错误折叠，形成IBs。IBs是胞质中折射性、电子致密的球形或圆柱形大分子（直径50-1000 nm），通常含有高浓度重组蛋白，部分具有生物活性，其结构依赖于培养条件，如培养时间、诱导剂浓度、生长速率、温度、搅拌和pH。但溶解氧张力（DOT）对热诱导系统中IBs结构的影响尚未被系统表征。

现有文献中，DOT对RP产量的影响已有共识：在化学诱导大肠杆菌培养中，控制DOT高于30%通常有益。但低DOT在某些情况下反而促进RP积累，例如在限制DOT下产气荚膜梭菌毒素A重复单元区的产量是未限制DOT的3倍，伴随翻译和能量生成途径上调。然而，也有报道显示高DOT增强RP产量，如结核分枝杆菌rCFP10在30% DOT时产量比15% DOT高1.4倍。氧限制影响抗原5的积累，但使其IBs含量增加。在热诱导大肠杆菌培养中，生物反应器控制30% DOT时rESAT-6产量接近摇瓶（近零DOT）的两倍，且摇瓶来源的IBs蛋白水解敏感性更高，热休克分子伴侣负载不同。

本研究的目的是评估诱导后DOT控制对使用λpL-cI857热诱导系统在大肠杆菌中生产rHuGM-CSF的影响，重点关注其对生物量、比生长速率、葡萄糖消耗和重组蛋白产量的影响，并特别关注DOT控制如何影响IBs的结构。

**关键技术与方法**
研究人员使用大肠杆菌W3110（ATCC^? 27325^TM）菌株，转化携带λpL-cI857系统的pV3-uri200N质粒（PROBIOMED S.A. de C.V.拥有），该质粒编码rHuGM-CSF（GenBank登录号OL419360），以卡那霉素为抗性标记。在1.2 L玻璃搅拌罐生物反应器（工作体积1.0 L）中进行补料分批培养，配备两个标准Rushton涡轮、L型分布器和加热夹套。诱导前培养于30°C、500 rpm、1.0 vvm通气条件下；当培养物达到3.0 A.U.的中指数生长期时，以0.37±0.03°C min^-1的速率升温至42°C启动热诱导。诱导后立即开始DOT控制，通过搅拌级联（400-1000 rpm）和PID控制策略设定DOT为5%、10%、30%和70%（70% DOT时使用纯氧脉冲）。pH通过2 M NaOH的PID控制维持在7.2±0.3。每个条件至少进行三次独立培养。主要分析方法包括：细胞浓度（OD₆₀₀转换为干重）、葡萄糖（生化分析仪YSI 2900）、有机酸（HPLC）、IBs纯化（超声破碎、离心、洗涤）、总蛋白和rHuGM-CSF定量（SDS-PAGE及光密度分析）、ATR-FTIR（二级结构分析）、蛋白酶K（PK）消化（IBs蛋白水解敏感性）、盐酸胍（GnHCl）溶解（IBs溶解性）、透射电镜（TEM）及动态光散射（DLS）测定IBs粒径。

**研究结果**
**细菌生长、葡萄糖消耗与有机酸产生**
在诱导后不同DOT控制下，热诱导表达rHuGM-CSF的大肠杆菌最终生物量相似，平均约4.5 g L^-1。诱导前比生长速率（μ）为0.56±0.03 h^-1。诱导后，70%和30% DOT培养物的μ分别为0.28±0.01 h^-1和0.32±0.04 h^-1，而10%和5% DOT培养物的μ较30% DOT分别降低约35%和44%。葡萄糖（17.5 g L^-1）在所有培养物中均在静止期前完全消耗。诱导后比葡萄糖消耗速率（q_s）在所有条件下均增加，30% DOT时最高（1.37±0.20 g g^-1 h^-1），但与70% DOT无显著差异。生物量对底物得率（Y_X/S）约为0.3 g g^-1。所有培养物中醋酸积累量均超过2.5 g L^-1，未检测到琥珀酸、苹果酸、甲酸和柠檬酸。温度、pH控制曲线相似，DOT控制通过调整搅拌速率实现。

**总细胞蛋白与rHuGM-CSF产量**
5%和10% DOT培养物的总蛋白积累最高，显著高于30%和70% DOT。蛋白对生物量得率（Y_P/X）在各条件间无显著差异（约0.33 g g^-1）。SDS-PAGE光密度分析显示，5%和10% DOT培养物中rHuGM-CSF积累量平均比30%和70% DOT高1.4倍。rHuGM-CSF在IBs中的比例约为45%，各DOT控制策略间无显著差异。5%和10% DOT培养物的rHuGM-CSF体积产量最高（490±100 mg L^-1和530±30 mg L^-1），几乎是30%和70% DOT的两倍（280±60 mg L^-1和320±100 mg L^-1）。rHuGM-CSF表达动力学依赖DOT：30% DOT在诱导后第一小时积累最快。rHuGM-CSF对生物量的得率（Y_rHuGM-CSF/X）在5%和10% DOT时分别为91±10 mg g^-1和98±7 mg g^-1，显著高于30% DOT（56±9 mg g^-1）和70% DOT（68±22 mg g^-1）。

**IBs的大小与结构**
ATR-FTIR分析显示，诱导后3小时，低DOT（5%和10%）培养物IBs的类淀粉样结构（~1626 cm^-1）光谱贡献弱于高DOT（30%和70%）；诱导后15小时，各条件下α-螺旋和类淀粉样结构特征趋于相似。蛋白酶K消化实验表明，15小时收获的IBs中，30%和70% DOT培养物的IBs对PK的抵抗性显著高于5%和10% DOT。盐酸胍溶解实验显示，诱导后3小时和15小时，低DOT培养物的IBs在2 M和4 M GnHCl中溶解性更高，而6 M GnHCl可完全溶解所有IBs。TEM观察显示，IBs主要为球形，但低DOT培养物中许多IBs呈椭球形或更细长形。IBs粒径累积频率分析表明，DOT越低，IBs越大：5% DOT时IBs直径最大（3 h: 0.67±0.23 μm，15 h: 0.79±0.09 μm），随后依次为10% DOT（0.52±0.15 μm，0.66±0.11 μm）、30% DOT（0.46±0.12 μm，0.59±0.13 μm）和70% DOT（0.36±0.09 μm，0.52±0.10 μm）。DLS测量结果与TEM一致。

**总结与讨论**
本研究通过控制诱导后DOT（5%-70%），系统评估了DOT对热诱导大肠杆菌W3110生产rHuGM-CSF及其IBs结构的影响。在分批培养条件下，低DOT（5%-10%）导致诱导后比生长速率降低，但总蛋白和rHuGM-CSF的产量最高，接近高DOT（30%-70%）的两倍。低DOT下IBs更大、类淀粉样含量更低、对蛋白酶K和低浓度盐酸胍的敏感性更高，表明其聚集体结构更松散、更易溶解。相反，高DOT（30%-70%）促进早期诱导后快速积累，但产生更小、更致密、富含类淀粉样结构的IBs，对蛋白水解和溶解的抵抗性更强。

研究结论：诱导后DOT是调控IBs形态、聚集状态和重组蛋白产量的有效过程参数，可策略性地用于改善热诱导大肠杆菌系统中重组蛋白的下游回收。低DOT下形成的IBs因含有较少高度有序的类淀粉样结构、超分子组织更松散，有利于溶解和后续复性；而高DOT下形成的致密、有序IBs可作为蛋白质基纳米材料用于酶固定化、生物材料支架、生物传感平台或药物递送载体。这是首次证明诱导后DOT控制可战略性地用于改善热诱导大肠杆菌系统中IBs的蛋白质回收。