通过单细胞与空间多组学解码肿瘤免疫微环境异质性：从免疫治疗耐药到转化性生物标志物

《Neoplasia》：Decoding tumor immune microenvironment heterogeneity by single-cell and spatial multi-omics: From immunotherapy resistance to translational biomarkers

　　

免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade, ICB）已变革癌症治疗，但原发性和获得性耐药仍是主要临床挑战。越来越多的证据表明，免疫治疗耐药不能完全由肿瘤内在改变或传统生物标志物（如PD-L1表达、肿瘤突变负荷（tumor mutational burden, TMB）或微卫星不稳定性（microsatellite instability, MSI））来解释。相反，治疗反应是由肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvironment, TIME）塑造的，它是一个异质性、空间组织化且动态演化的生态系统。单细胞组学（single-cell omics）揭示了多样化的免疫和基质细胞状态，包括祖细胞样和终末耗竭T细胞、抑制性髓系程序、B细胞/三级淋巴结构（tertiary lymphoid structure, TLS）相关免疫反应状态，以及癌症相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblast, CAF）介导的排斥表型。空间转录组学（spatial transcriptomics）、空间蛋白质组学（spatial proteomics）和基于成像的方法进一步表明，这些细胞状态组装成不同的免疫生态位，包括免疫炎症型、T细胞排斥型、髓系抑制型、代谢/缺氧型和TLS相关生态位。这些空间生态系统决定了抗肿瘤免疫细胞是否能接近恶性细胞、获得抗原呈递支持，或受到基质、血管、代谢和髓系屏障的约束。在这篇综述中，研究人员总结了单细胞和空间多组学如何在免疫治疗耐药中重新定义TIME异质性，强调了连接细胞状态与空间免疫功能障碍的配体-受体（ligand–receptor）通讯网络，并讨论了用于患者分层的新兴转化性生物标志物。研究人员进一步提出，未来的免疫治疗生物标志物应从静态的单标记检测，发展为纵向、空间分辨且可解释的多组学模型，以指导精准的联合免疫治疗。

研究背景、现存问题与开展研究的原因

免疫检查点阻断（ICB）疗法，如靶向程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）、程序性死亡配体1（PD-L1）和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）的抗体，已在多种恶性肿瘤中展现出持久疗效，但仅部分患者能获得长期获益，原发性和获得性耐药仍是主要临床难题。传统生物标志物，包括PD-L1表达、肿瘤突变负荷（TMB）和微卫星不稳定性（MSI），在一定程度上改善了患者分层，但不足以充分解释ICB反应的复杂性。PD-L1表达存在空间异质性和动态调节，TMB提供新抗原潜力信息却无法直接反映抗原呈递或T细胞适应性，而MSI仅适用于有限比例的患者。越来越多的证据表明，肿瘤免疫微环境（TIME）是决定免疫治疗反应和耐药的核心因素，它并非简单的细胞混合物，而是由恶性细胞、T细胞、B细胞、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）、树突状细胞（DC）、成纤维细胞（CAF）、内皮细胞、细胞外基质（ECM）及代谢梯度构成的高度组织化、异质性的生态系统，这些组分形成空间上结构化的生态位，或支持抗肿瘤免疫，或强化免疫抑制。因此，ICB耐药不应仅被视为肿瘤细胞内在现象，而应理解为特定空间和功能背景下多种细胞类型动态互作的结果。研究人员为深入理解这一生态系统，开展了本研究。

研究人员开展的研究、结论与意义

研究人员总结并分析了近年来利用单细胞和空间多组学技术解码TIME异质性的代表性研究，这些技术包括单细胞RNA测序、空间转录组学、空间蛋白质组学、成像质谱流式等。研究发现，单细胞组学揭示了免疫和基质细胞状态的高度异质性：T细胞并非单一群体，而是包含细胞毒性、祖细胞样耗竭、终末耗竭、组织驻留记忆样、调节性T细胞等多种状态，其耗竭呈连续谱系；髓系细胞（如巨噬细胞、单核细胞）超越了传统的M1/M2二分法，存在抗原呈递、炎症、组织重塑、血管生成、免疫抑制等多种功能程序；B细胞及三级淋巴结构（TLS）相关状态支持局部适应性免疫；CAF则包含免疫排斥、结构支持等不同亚群。空间组学进一步揭示了这些细胞状态如何组装成功能各异的生态位，包括免疫炎症型、T细胞排斥型（由CAF、ECM和血管屏障驱动）、髓系抑制型、代谢/缺氧型以及TLS相关免疫反应型。空间生态位决定了抗肿瘤免疫细胞能否接近并杀伤恶性细胞。配体-受体通讯网络分析将细胞状态与空间免疫功能障碍联系起来，如CAF通过CXCL12-CXCR4、TGFB1-TGFBR等轴排斥T细胞，TAM通过SPP1-CD44、CSF1-CSF1R等通路抑制T细胞活性。在此基础上，研究人员提出未来免疫治疗生物标志物应从静态单标记发展为动态、空间分辨、可解释的多组学模型，以指导精准联合免疫治疗。该论文发表在《Neoplasia》。

主要关键技术方法

研究人员主要采用单细胞组学技术（如单细胞RNA测序scRNA-seq、单细胞ATAC测序scATAC-seq、TCR/BCR测序）解析细胞转录、表观和克隆状态；空间组学技术（如空间转录组学、空间蛋白质组学、成像质谱流式imaging mass cytometry、多重免疫荧光）保留组织架构以定位细胞状态；并整合多组学数据进行配体-受体通讯网络分析和AI集成多组学生物标志物建模。研究涉及的样本队列来源包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌肝转移、黑色素瘤、脑肿瘤等多种癌症类型。

研究结果

**T-cell heterogeneity: from cytotoxicity to exhaustion and response-associated states** 通过泛癌单细胞T细胞图谱研究，发现肿瘤浸润T细胞处于细胞毒性、记忆样、组织驻留、调节性、祖细胞样耗竭和终末耗竭等多种状态的连续谱系中。祖细胞样耗竭T细胞（常与TCF1/TCF7相关）保留增殖能力和对PD-1/PD-L1阻断的反应性，而终末耗竭T细胞功能固定。在乳腺癌中，CXCL13⁺ T细胞被鉴定为与PD-L1阻断治疗反应相关的免疫状态。

**Myeloid heterogeneity: macrophages, monocytes, dendritic cells and suppressive niches** 泛癌单细胞髓系细胞图谱研究揭示了TAM、单核细胞和DC的多种转录和功能状态，超越了M1/M2模型。这些状态包括抗原呈递、炎症、免疫调节、血管生成、组织重塑和抑制性程序。在结直肠癌肝转移中，MRC1⁺CCL18⁺ M2样巨噬细胞被鉴定为转移性免疫抑制微环境的关键组分。在非小细胞肺癌（NSCLC）中，整合单细胞和空间转录组学分析将髓系程序与T/NK细胞活性降低相关联。

**B cells and TLS-associated immune-reactive states** 泛癌B细胞图谱研究揭示了肿瘤浸润B细胞的多样化分化状态，包括幼稚样、记忆样、生发中心样、浆细胞和抗体分泌程序。B细胞和TLS相关生态位支持局部抗原呈递、T细胞启动和协调的适应性免疫，与ICB治疗预后改善和反应增加相关。

**CAF heterogeneity and context-dependent stromal immune regulation** 单细胞研究显示CAF具有高度异质性。特定的CAF-S1亚群通过促进调节性T细胞（Treg）的招募、存活和分化，以及通过TGF-β、CXCL12等信号轴和ECM重塑，形成免疫排斥屏障，与免疫治疗耐药相关。

**Therapy-induced dynamic immune states revealed by single-cell omics** 纵向单细胞研究（如乳腺癌抗PD-1治疗、NSCLC新辅助免疫治疗）表明，TIME在治疗压力下动态演变。反应性肿瘤出现T细胞激活、克隆扩增和免疫重塑，而耐药性肿瘤则维持或发展出抑制性程序。

**Tumor–microenvironment interface as an active spatial compartment** 空间转录组学分析显示，肿瘤-微环境界面并非被动的解剖边界，而是包含特异性转录程序和细胞互作的活跃调控区，决定免疫细胞的进入。

**T-cell-excluded niches: CAF, ECM and vascular barriers** 空间分析鉴定出T细胞排斥生态位，其中T细胞存在于基质区域但无法穿透恶性细胞巢，主要由CAF、致密ECM和异常血管驱动。

**Myeloid-suppressive niches: TAMs, MDSCs, neutrophils and spatial immune paralysis** 空间分析鉴定出髓系抑制生态位，由TAM、单核细胞、髓系来源抑制细胞（MDSC）和中性粒细胞主导，通过抑制性细胞因子和代谢限制导致局部免疫麻痹。

**Immune-reactive and TLS-associated niches** 空间分析鉴定出TLS相关免疫反应生态位，包含B细胞、T细胞、DC和浆细胞，为局部抗原呈递和适应性免疫提供组织化平台。

**Ligand–receptor communication networks** CAF通过CXCL12-CXCR4、TGFB1-TGFBR轴与T细胞/ Treg通讯，TAM通过SPP1-CD44、CSF1-CSF1R、CCL2-CCR2、IL10-IL10R等轴与T细胞通讯，形成抑制性网络。T细胞-B细胞-DC通过CXCL13-CXCR5、CD40-CD40L、ICOS-ICOSL等轴形成免疫反应性网络。

**Translational biomarkers: from multi-omics discovery to clinical stratification** 研究人员提出生物标志物应整合单细胞状态（如CXCL13⁺ T细胞、祖细胞样耗竭T细胞、抑制性髓系程序）、空间特征（如肿瘤-免疫邻近性、T细胞排斥模式、TLS组织）和动态变化，形成AI集成的多组学生态系统评分，以指导患者分层和联合治疗选择。

**Therapeutic implications: targeting spatial immune resistance ecosystems** 治疗策略应匹配主导的免疫抗性生态位：T细胞耗竭可结合ICB与额外检查点阻断；髓系抑制生态位需要CSF1R、CCR2或TREM2靶向等重编程策略；基质排斥屏障需联合TGF-β、CXCL12或血管靶向；免疫冷肿瘤需放疗、疫苗、STING激动剂等启动策略。

总结讨论与结论

研究人员讨论了单细胞和空间多组学在转化应用中面临的挑战，包括TIME的生物学异质性（跨癌种、转移部位、病灶和时间点）、技术平台的可重复性、计算整合的复杂性以及临床验证的困难。结论部分指出，ICB疗法已变革癌症治疗，但原发性和获得性耐药仍是主要临床障碍。来自单细胞和空间多组学研究的证据表明，免疫治疗耐药不能完全由肿瘤内在改变或传统生物标志物来解释。相反，治疗反应是由肿瘤免疫微环境（TIME）塑造的，它是一个异质性、空间组织化且动态演化的生态系统。单细胞组学通过揭示具有不同功能意义的多样化免疫和基质细胞状态，重新定义了TIME。空间组学则为这一框架增加了关键的架构层，将肿瘤组织解析为免疫炎症型、T细胞排斥型、髓系抑制型、代谢/缺氧型和TLS相关免疫反应型等空间生态位。重要的是，TIME并非静态，基线生物标志物仅提供动态治疗过程的初始快照。纵向单细胞和空间分析能够区分反应轨迹，识别早期治疗生物标志物，并分离先天性与获得性耐药机制。从转化角度来看，下一代免疫治疗生物标志物应超越单一标记如PD-L1、TMB或MSI，采用单细胞衍生生物标志物、空间生物标志物和AI集成的多组学模型。这些进展也具有治疗意义，多组学图谱应指导合理的治疗选择，将空间免疫生态系统图谱转化为精准联合免疫治疗。未来生物标志物开发应从静态单标记检测向可解释、纵向、空间分辨的免疫生态系统模型发展，此类模型有望改善患者分层、早期检测耐药、指导合理联合治疗，并最终将精准免疫治疗从群体水平策略转变为患者特异性的、生态位指导的治疗方法。