空间和单核转录组学揭示乳头状和未分化甲状腺癌中的特异性和通用性模式

《Molecular Oncology》：Spatial and single-nuclei transcriptomics reveals idiosyncratic and generic patterns in papillary and anaplastic thyroid cancers

　　

百分之六十的乳头状甲状腺癌（PTC）由BRAF^V600E驱动，该突变与高肿瘤间和肿瘤内异质性相关。PTC可能发展为高度侵袭性的未分化甲状腺癌（ATC）。虽然单细胞转录组学可以解析这种异质性，但它可能受到技术效应的干扰，而这些效应的校正可能会削弱肿瘤间变异。研究人员利用单核RNA测序（snRNA-seq）和空间转录组学（spRNA-seq）对ATC和BRAF^V600E PTC进行分析，并采用一种实验设计来区分生物学和技术变异。结果表明，癌细胞和几种免疫细胞类型中的大量转录变异是特异性的，即肿瘤特异性，这一现象在众多单细胞研究中被批次整合所掩盖。在某些情况下，特异性与基因组异常和整体组织状态（如缺氧）相关。除特异性外，分化标记物SLC5A5（NIS）、TPO、TG和TSHR以一种顺序丢失，该顺序与人类甲状腺类器官成熟过程中这些标记物的获得顺序镜像对应，提示了一种新的癌细胞状态分类。PTC细胞保留TSHR表达，并显示出部分上皮间充质转化（EMT）的特征，伴有FN1的大量表达，FN1通过自分泌环路促进增殖。相比之下，ATC则经历完全EMT，表达间质细胞外成分并丢失TSHR。最后，研究人员表明癌细胞的微环境由炎症驱动。这些发现可能有助于未来对BRAF^V600E PTC进行分层。

**研究背景与问题**：甲状腺癌（TC）是最常见的内分泌恶性肿瘤，其中乳头状甲状腺癌（PTC）占70%–90%，而未分化甲状腺癌（ATC）虽罕见但致死率极高。约60%的PTC携带BRAF^V600E突变，该突变与高度肿瘤间和肿瘤内异质性相关，且PTC可能进展为ATC。既往基于bulk测序的TCGA项目虽揭示了PTC的异质性，但无法解析低纯度肿瘤或亚克隆多样性。单细胞RNA测序（scRNA-seq）可解决这一问题，但其数据处理中广泛使用的批次效应校正算法可能削弱真实的生物学差异，而现有实验设计无法区分技术和生物学变异。因此，研究人员旨在通过实验设计区分二者，并系统解析PTC和ATC的异质性。
**研究内容与结论**：研究人员对10例BRAF^V600E PTC和6例ATC样本（来自4例患者）进行单核RNA测序（snRNA-seq）和空间转录组学（spRNA-seq）分析，结合多重免疫荧光（MIF）和TCGA数据。通过细胞混合实验证明，转录变异主要源于生物学因素而非技术因素，且癌细胞和多种免疫细胞类型存在肿瘤特异性（idiosyncratic）表达状态。发现分化标记物SLC5A5（NIS）、TPO、TG和TSHR在癌症中按顺序丢失，与甲状腺类器官分化中的获得顺序相反，据此提出新的上皮细胞状态分类。PTC细胞保留TSHR表达，呈现部分上皮间充质转化（EMT），并大量表达FN1，后者通过自分泌环路促进增殖；ATC细胞则发生完全EMT，丧失TSHR。微环境特征显示，B细胞和T细胞在部分PTC中富集，且B细胞与甲状腺炎背景相关；ATC中髓系细胞存在缺氧相关特异性表达。
**重要意义**：该研究揭示了传统批次校正可能掩盖的肿瘤特异性变异，为未来基于单细胞技术的甲状腺癌分层提供了新框架，并强调了结合空间转录组学与组织形态学分析的价值。论文发表在《Molecular Oncology》。
**技术方法**：主要关键技术包括：（1）单核RNA测序（snRNA-seq），利用10X Genomics平台对91,632个细胞核进行转录组分析，并进行背景RNA去除（SoupX）和双细胞去除（DoubletFinder）；（2）空间转录组学（spRNA-seq），基于改良的Salmén等方案，对37个组织切片（来自7个样本）进行空间转录组分析；（3）多重免疫荧光（MIF），用于验证蛋白表达和组织结构；（4）细胞混合实验，通过提取患者特异性SNP（来自spRNA-seq），利用Vireo进行细胞身份鉴定，以区分生物学和技术变异；（5）基于TCGA-THCA队列（234例BRAF^V600E PTC）的CIBERSORTx反卷积分析。样本来自Institut Jules Bordet和Centre Hospitalier Universitaire de Liège的生物样本库。
**研究结果**：
**3.1 样本匹配的单核和空间转录组**：研究人员对10例PTC和6例ATC样本进行了snRNA-seq和spRNA-seq分析，共获得91,632个细胞核和37个组织切片的空间转录组数据。
**3.2 细胞混合实验证明特异性的上皮和非上皮细胞状态**：通过混合ATC1和ATC2细胞核的实验，发现聚类主要基于患者身份而非实验批次，证明生物学变异主导转录组差异，且批次效应可忽略。
**3.3 微环境在大小和空间分布上具有特异性，并与全身特征（如甲状腺炎或缺氧）相关**：通过细胞类型比例分析和TCGA验证，发现微环境组成存在三种类别：ATC具有最特异性组成；PTC中B细胞和T细胞显著富集，其中B细胞与甲状腺炎背景正相关；髓系细胞在ATC中呈现缺氧相关特异性表达。
**3.4 经典滤泡细胞标记物在癌症中丢失的顺序与甲状腺类器官分化顺序相反，提示PTC和ATC上皮细胞状态的新分类**：基于四个标记物（TSHR、TPO、TG、NIS）的表达，发现细胞去分化过程中标记物丢失顺序与类器官分化中的获得顺序镜像对应，并据此将上皮细胞分为六类：NIS⁺、TPO⁺、TPO^low、TPO^?、TSHR^low、TSHR^?。
**3.5 TSHR^low/?细胞发生完全EMT，仅存在于ATC中**：TSHR^low和TSHR^?细胞为ATC特异性，表达间质标记物（如ZEB1相关调控），且增殖活跃（TOP2A阳性率6%–14%），而PTC细胞增殖缓慢（<0.4%）。
**3.6 TSHR⁺/TPO^?细胞是PTC的标志，其高度特异性状态部分与DNA拷贝数变异和形态学相关**：通过inferCNV分析，发现PTC2存在13号染色体缺失和3、7、8号染色体获得，且与TG表达降低和上皮结构改变相关；PTC4存在13号染色体缺失；PTC9无拷贝数变异但仍有特异性表达。
**3.7 TSHR⁺/TPO^?细胞的间质特征（包括FN1产生）在单个PTC内高度可变**：FN1在BRAF^V600E PTC中过表达（TCGA中100倍上调），且主要由癌细胞产生。空间转录组学显示，FN1高表达区域与甲状腺分化标记物低表达区域对应，且与上皮结构丧失相关。
**3.8 FN1通过自分泌环路增加癌细胞增殖**：通过CellChat分析和小鼠胚胎干细胞来源的甲状腺类器官实验，证实FN1与其受体形成自分泌环路，FN1处理使Braf诱导的癌细胞增殖率增加1.77倍。
**总结讨论与结论**：
**讨论部分**：研究人员通过细胞混合实验证明，转录变异主要源于生物学因素，而非技术因素，且批次校正算法可能掩盖肿瘤特异性信号，提出系统性应用细胞混合实验以避免这一缺陷。研究还发现，微环境特异性（如B细胞与甲状腺炎的关联、髓系细胞的缺氧状态）和上皮细胞去分化顺序（与类器官分化镜像对应）有助于理解疾病异质性。FN1的自分泌作用提示其可能成为治疗靶点。但研究样本量有限，且ATC样本无BRAF突变，限制了肿瘤类型间的直接比较。
**结论部分**：总之，该数据集提供了有助于开发新治疗策略、改善甲状腺癌患者风险分层和深化疾病理解的见解。研究人员确认了先前发表的发现，并强调了潜在的新方向，但最重要的是，展示了结合单细胞分辨率RNA测序与组织成像以更好地把握这种高度异质性疾病的多个方面的潜力。一些发现需要使用不同模型进一步研究，例如，可精细调控BRAF癌基因激活水平的人甲状腺类器官模型，可能揭示所观察到的分层是BRAF突变甲状腺细胞去分化过程的基本特征，还是也源于与微环境的相互作用。其他发现需要通过更大规模的研究来确认，这些研究可以借鉴本文的技术经验，设计最佳实验方案，从而获得甲状腺癌的完整图景。