使用SYBR Green qPCR和R软件稳健HRM分析简便检测水稻基因OsMADS26、OsRAC1和OsNRT1.1b中CRISPR/Cas9诱导的插入、缺失和替换

《New Biotechnology》：Easy detection of CRISPR/Cas9-Induced Insertions, Deletions, and Substitutions in Rice Genes OsMADS26, OsRAC1 and OsNRT1.1b using SYBR Green qPCR and Robust HRM analysis in R software

　　

水稻是全球粮食和营养安全的主要谷类作物，也是遗传改良的关键目标。CRISPR/Cas9能够在作物中进行精确遗传修饰，但突变筛选仍然是更广泛基因组编辑应用的技术和经济障碍。尽管已有多种检测方法，但一些方法需要劳动密集型流程、专门设备、高成本，或对特定突变类型的敏感性有限。高分辨率熔解曲线分析（HRM）是一种已建立的筛选植物（包括水稻）中CRISPR/Cas诱导突变的方法。在此，研究人员评估了一种适应性HRM工作流程，该流程将常规SYBR Green定量PCR（qPCR）化学与下游计算分析相结合，以检测三个水稻基因座（OsMADS26、OsRAC1和OsNRT1.1b）中的CRISPR/Cas9诱导突变。该工作流程检测到了插入、缺失和碱基替换。在评估条件下，三个基因座的1%编辑DNA混合物显示出与野生型熔解曲线的轻微可观察偏差，但这不应被解释为经过验证的检测阈值。尽管杂合样本的评估受其可用性限制，但结果支持该方法在个体样本分析和扩大样本筛选中的潜在适用性。可定制的R脚本通过评估熔解温度（Tm）和基因型置信百分比（GCP）衍生的相异度来补充视觉分析，支持样本分类。通过将标准SYBR Green化学与适应性分析工作流程相结合，该方法为专用HRM试剂和专有平台提供了一种替代方案。该方法为所评估水稻基因座的突变筛选提供了一种实用且可能成本较低的选择，并可能适用于其他靶标和植物物种。

水稻是全球粮食安全的重要作物，也是遗传改良的关键目标。CRISPR/Cas9技术为作物精准育种提供了高效工具，但突变筛选环节的技术复杂性和经济成本仍是制约其广泛应用的主要瓶颈。现有检测方法如T7核酸内切酶I（T7E1）分析、单链构象多态性（SSCP）分析、等位基因特异性PCR及Hi-TOM高通量平台等，虽能有效鉴定编辑事件，但分别存在操作繁琐、灵敏度有限、成本高昂或依赖专用设备等问题。高分辨率熔解曲线分析（HRM）是已建立的突变筛选方法，但通常需要专用试剂和平台。为此，研究人员评估了一种将常规SYBR Green定量PCR（qPCR）化学与基于R软件的下游计算分析相结合的适应性HRM工作流程，用于检测三个水稻基因——OsMADS26、OsRAC1和OsNRT1.1b中的CRISPR/Cas9诱导突变。该研究发表于《New Biotechnology》。研究结果表明，该工作流能够区分插入、缺失和碱基替换突变，并在个体样本分析和扩大筛选中表现出可行性，为资源受限实验室提供了一种低成本、可访问的突变筛选替代方案。

研究人员使用先前生成的编辑水稻品系，包括OsMADS26（Nipponbare背景，T2代）、OsRAC1（Kitaake背景，T0代）和OsNRT1.1b（Kitaake背景，T2代）。采用改良的混合烷基三甲基溴化铵（MATAB）法提取基因组DNA；以SYBR Green qPCR在LightCycler 96仪器上进行扩增和熔解曲线采集；使用自定义R脚本分析荧光数据，计算熔解温度（Tm）和基因型置信百分比（GCP）衍生的相异度，并通过层次聚类、主坐标分析（PCoA）、置换多元方差分析（PERMANOVA）和受试者工作特征（ROC）/曲线下面积（AUC）进行探索性分析。

**通过qPCR-HRM检测诱导的CRISPR/Cas9突变**：针对每个基因，研究人员比较了野生型和编辑型样本的衍生熔解曲线、归一化荧光曲线、差异曲线及层次聚类结果。对于OsMADS26，编辑型为单碱基（A）插入，Tm约为86.6°C，野生型约为87.4°C；对于OsRAC1，编辑型为1–2 bp缺失，Tm约为85.80°C，野生型约为85.10°C；对于OsNRT1.1b，编辑型为C>T碱基替换，Tm约为91.7°C，野生型约为92.4°C。Sanger测序确认了所有突变类型。这表明该工作流能够区分纯合编辑与野生型样本。

**编辑/野生型DNA混合物分析与扩大样本筛选**：将编辑DNA以1%、5%、10%、25%、50%和70%比例与野生型DNA混合。结果显示，1%编辑DNA混合物在三个基因座均显示出与野生型熔解曲线的轻微可观察偏差，但随着比例增加，曲线逐渐向编辑型偏移，且偏差幅度不与百分比成比例，因此该实验仅为初步评估，并非验证的检测限。扩大筛选在OsMADS26（15个样本，含5个野生型和10个编辑型）和OsNRT1.1b（32个样本，含4个野生型和28个编辑型）中进行，样本按基因型正确聚类。OsMADS26的Tm分析显示野生型（平均87.40°C）与编辑型（平均86.77°C）差异显著（Welch's t检验，p = 6.6 × 10^?5）；基于GCP相异度的PERMANOVA也显著（R² = 0.8807，p = 0.002），探索性ROC AUC为0.78。OsNRT1.1b的Tm分析同样显著（编辑型平均91.68°C，野生型平均92.36°C，p = 2.20 × 10^?5）；PERMANOVA显著（R² = 0.5436，p = 0.001），但组间样本数不平衡（4个野生型对28个编辑型），ROC AUC为0.99仅作描述性解释。这表明Tm和GCP相异度提供了互补信息，支持样本分类。

讨论部分指出，该工作流结合标准SYBR Green化学和可定制R脚本，避免了对专用HRM试剂和专有软件平台的依赖。与T7E1、Sanger测序、探针qPCR、微滴数字PCR（ddPCR）及数字CRISPR平台相比，该方法在成本、复杂度和通量方面处于中间位置，适合作为初步筛选工具。但性能受染料化学、突变类型、扩增子特征和仪器分辨率影响，且杂合样本评估有限，需进一步跨位点、跨物种验证。结论部分翻译如下：总之，研究人员的数据表明，SYBR Green qPCR结合HRM导向分析可用于检测本研究评估的水稻靶标中不同类型的CRISPR/Cas9诱导突变，既适用于个体样本分析，也适用于筛选检测。后qPCR分析流程的开发可减少对专用HRM试剂和专有软件的依赖，支持其作为可访问的工作流程。所实现的基于R的工作流程具有灵活性，可适应不同数据集。然而，需要在更多位点、基因型、仪器和作物物种中进行进一步验证，以确定其更广泛的适用性和分析性能。