《Cancer Science》：Decreased Expression by a Chemically Modified siRNA to PTBP1 Seriously Affects Warburg Effect in Colorectal Cancer Cells
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癌症细胞优先依赖有氧糖酵解（即Warburg效应）以支持生长和存活。研究人员先前已证明，多聚嘧啶区结合蛋白1（polypyrimidine tract–binding protein 1，PTBP1）通过调控丙酮酸激酶异构体的剪接维持PKM2优势，从而维持Wa
癌症细胞优先依赖有氧糖酵解（即Warburg效应）以支持生长和存活。研究人员先前已证明，多聚嘧啶区结合蛋白1（polypyrimidine tract–binding protein 1，PTBP1）通过调控丙酮酸激酶异构体的剪接维持PKM2优势，从而维持Warburg表型。PTBP1抑制可使代谢转向PKM1优势，增强氧化磷酸化、活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生、凋亡和抗肿瘤免疫。研究人员合成了13种靶向PTBP1 mRNA编码区或3′-非翻译区（3′-untranslated region，3′-UTR）的化学修饰siR-PTBP1衍生物，并在结直肠癌细胞系中进行了评价。通过基于细胞的检测、免疫印迹和代谢组学分析评估了细胞毒性、蛋白表达、氧化应激和代谢改变。在核酸酶暴露后评价siRNA稳定性，并通过TaqMan RT-qPCR定量。靶向3′-UTR的siRNA比靶向编码区的siRNA更有效地抑制PTBP1表达并增加PKM1/PKM2比值。其中，衍生物2-6显示出最强的细胞毒性，并伴有氧化应激和凋亡。代谢组学分析显示糖酵解通量改变，磷酸戊糖途径中间产物保留，氧化还原反应激活，而腺苷酸和鸟苷酸能量荷保持可行，表明细胞处于代谢应激状态而无能量崩溃。三羧酸循环代谢物升高，与增强的氧化磷酸化一致。衍生物2-6表现出对核酸酶介导降解的抗性。直接敲低PKM2未诱导相当的细胞毒性。化学修饰的siR-PTBP1，特别是衍生物2-6，诱导以氧化失衡为特征的代谢脆弱状态，导致凋亡。这些发现将PTBP1确定为Warburg效应的关键调控因子，并支持基于siRNA的代谢靶向作为治疗策略。
论文解读：化学修饰siRNA靶向PTBP1诱导结直肠癌代谢重编程与凋亡
一、研究背景与问题
近年来，多模式癌症治疗的发展使癌症患者总体10年生存率提升至59.4%，但复发性和难治性癌症的预后仍然较差，亟需超越现有治疗策略的新型方法。基于下一代测序的基因组分析揭示，癌基因突变不仅在相同肿瘤类型的患者间存在差异，甚至在单个患者的不同肿瘤区域内也不一致，导致针对单一癌基因的传统分子靶向药物疗效有限且易产生耐药。代谢组学研究显示，癌细胞无论氧气供应如何，均优先依赖糖酵解而非三羧酸循环产生ATP，此即Warburg效应。该效应具有三项主要功能：通过磷酸戊糖途径增强核酸合成；抑制线粒体氧化磷酸化产生的ROS以促进细胞存活；通过向胞外分泌乳酸调节肿瘤免疫。既往研究已表明，多聚嘧啶区结合蛋白1（PTBP1）作为剪接调控因子，通过调控丙酮酸激酶M1/M2（PKM1/PKM2）异构体的选择性剪接，维持PKM2优势表达，从而支撑Warburg表型。然而，早期采用miRNA或常规siRNA抑制PTBP1的尝试受限于稳定性不足和活性短暂，限制了其治疗应用。因此，本研究旨在通过优化化学修饰的siRNA衍生物，提高PTBP1沉默效率，阐明PTBP1在调控Warburg效应中的核心作用，并评估其作为结直肠癌治疗策略的潜力。
二、研究内容与结论
研究人员设计并合成了13种化学修饰的siR-PTBP1衍生物，分别靶向PTBP1 mRNA的编码区或3′-非翻译区（3′-UTR），并在结直肠癌细胞系DLD-1和HT29中筛选其沉默效率与细胞毒性。研究发现，靶向3′-UTR的siRNA较编码区靶向siRNA能更有效地抑制PTBP1表达并提高PKM1/PKM2比值。其中衍生物2-6表现出最强的PTBP1敲低效率、最高的PKM1/PKM2比值和最强的细胞毒性，IC50约为0.38 nM。衍生物2-6在核酸酶富集环境中表现出显著增强的稳定性和功能持久性。代谢组学分析显示，PTBP1抑制导致糖酵解通量改变、磷酸戊糖途径中间产物保留、氧化还原反应激活、三羧酸循环代谢物显著升高，同时腺苷酸和鸟苷酸能量荷虽下降但仍处于生理可行范围，表明细胞进入一种代谢应激但未发生能量崩溃的中间状态。衍生物2-6处理还诱导ROS产生增加、ATP生成时间依赖性升高，并通过外源性和内源性凋亡途径（cleaved caspase-8、caspase-9、caspase-3及PARP）诱导细胞凋亡。直接敲低PKM2仅产生生长抑制而无凋亡特征，说明PTBP1抑制引起的细胞毒性并非单纯由PKM2下调介导，而是整体代谢重编程的结果。该研究得出结论：化学修饰的siR-PTBP1衍生物2-6通过抑制PTBP1、提高PKM1/PKM2比值、逆转Warburg效应、增强氧化磷酸化、诱导氧化应激和凋亡，有效抑制结直肠癌细胞生长，为基于siRNA的代谢靶向治疗提供了有力依据。论文发表在《Cancer Science》。
三、主要关键技术方法
该研究使用了以下关键技术方法：临床样本分析采用免疫组织化学和western blotting检测结直肠癌组织及癌旁正常黏膜中PTBP1、PKM1、PKM2蛋白表达；细胞实验采用化学修饰siRNA转染（Lipofectamine RNAiMAX）于DLD-1和HT29结直肠癌细胞系；细胞活力检测采用结晶紫染色（CVS）和直接细胞计数计算IC50；蛋白表达分析采用western blotting；凋亡检测采用Hoechst 33342染色及凋亡相关蛋白（cleaved PARP、caspase-3/8/9、Bcl-xL、RIP）分析；ROS检测采用DCFDA荧光染色；siRNA稳定性评价采用TaqMan RT-qPCR和预孵育后功能活性测定；代谢组学分析采用毛细管电泳-飞行时间质谱（CE-TOFMS）和CE三重四极杆质谱（CE-QqQMS），定量糖酵解、TCA循环、磷酸戊糖途径、核苷酸代谢和氧化还原相关代谢物。临床样本来自日本岐阜大学医院胃肠外科手术患者。
四、研究结果
1. PTBP1和PKM异构体在临床结直肠癌样本中的表达
通过western blotting和免疫组织化学分析10例结直肠癌患者的肿瘤及癌旁组织，发现5/10的肿瘤样本PTBP1高表达；多数肿瘤组织中PKM2表达高于PKM1且较癌旁黏膜升高，提示Warburg效应激活。免疫组化显示肿瘤细胞核内PTBP1强阳性，即使western blotting低表达的病例也呈核阳性，表明PTBP1在肿瘤组织中普遍存在。
2. 化学修饰siR-PTBP1衍生物的筛选
设计13种靶向编码区或3′-UTR的化学修饰siRNA，western blotting显示5种衍生物（2-3、2-4、2-6、2-8、2-9）显著降低DLD-1细胞PTBP1蛋白水平，其中2-6敲低效率最强。细胞活力筛选显示2-4和2-6显著抑制细胞生长，2-6细胞毒性最强，IC50约0.38 nM，而2-1为2.49 nM，表明化学修饰显著增强效能。
3. PTBP1抑制增加PKM1/PKM2比值并诱导细胞毒性
3 nM衍生物2-6处理后，PTBP1显著抑制，PKM1表达明显增加，PKM1/PKM2比值较对照升高2倍以上。使用两种独立siRNA直接敲低PKM2虽有效降低PKM2蛋白，但未诱导LC3B-II积累或PARP裂解，仅产生中度生长抑制，表明PKM2单敲低不足以触发细胞死亡，PTBP1抑制通过更广泛的代谢重编程发挥作用。此外，2-6处理降低c-Myc表达，而c-Myc敲低也降低PTBP1，提示c-Myc可能参与调控PTBP1。
4. 化学修饰增强核酸酶抗性并保留功能活性
TaqMan RT-qPCR显示，衍生物2-6在培养基中24小时内的残留量显著高于2-1。功能实验表明，2-6在预孵育24小时后仍保持强细胞毒性，而2-1失去活性，证实化学修饰提高了胞外核酸酶抗性和功能持久性。
5. 衍生物2-6在HT29细胞中的效果
在HT29细胞中，2-6同样显著抑制PTBP1、增加PKM1、提高PKM1/PKM2比值并产生强细胞毒性，IC50值与DLD-1相当，证明其效果在不同结直肠癌细胞系中具有可重复性。
6. 代谢应激、ROS产生与凋亡诱导
ATP检测显示，2-6处理后ATP水平随时间显著增加，提示代谢向线粒体氧化磷酸化部分转变。DCFDA荧光染色显示36小时ROS水平升高，2 nM浓度下ROS最高，3 nM时因大量细胞死亡导致信号降低。Hoechst染色观察到核浓缩和碎裂的凋亡形态。Western blot显示cleaved caspase-3和caspase-8在36小时早期诱导，cleaved PARP在后期增强，Bcl-xL表达下降，cleaved caspase-9可检测到，提示外源性和内源性凋亡通路均参与。
7. 代谢组学揭示PTBP1抑制诱导氧化代谢应激
转染后36小时进行代谢组学分析，发现TCA循环代谢物（柠檬酸、顺乌头酸、异柠檬酸、2-氧戊二酸）显著上调，PPP中间产物（如PRPP）保留，GSH显著增加而GSSG无显著变化，NADPH/NADP+比值呈下降趋势。乳酸/丙酮酸比值升高但无统计学意义。AEC和GEC显著下降但仍处于生理可行范围，表明代谢应激但未发生能量崩溃。PKM2蛋白水平在siR-PTBP1处理后几乎不变，提示部分保留PKM2可能是一种适应性反应，以维持糖酵解通量和PPP介导的氧化还原平衡。
五、讨论与结论
讨论部分指出，PTBP1通过剪接调控维持PKM2优势是Warburg效应的关键机制。临床样本中PTBP1的核定位与其剪接调控功能一致。PKM2部分残留可能反映其在糖酵解外的非代谢功能，如核内转录调控和STAT3信号激活，癌细胞可能保留基础PKM2水平以维持增殖信号。代谢组学显示PTBP1抑制将癌细胞推入代谢应激但可生存的中间状态，TCA循环增强和ATP产生增加支持氧化磷酸化转向，过量线粒体ROS在抗氧化能力不足时触发凋亡。AEC在36小时显著降低而48小时ATP升高，说明ATP丰度与能量状态不等价，反映高ATP周转和代谢适应。直接PKM2敲低仅产生抑细胞效应，而2-6诱导凋亡，说明PTBP1抑制介导的异构体转换和网络级代谢重塑是细胞毒性的基础。3′-UTR靶向策略因序列独特性和种间保守性提供更高特异性，化学修饰（2′-氟和硫代磷酸酯骨架）增强核酸酶抗性和稳定性。研究结论表明，化学修饰siRNA靶向PTBP1 3′-UTR通过将代谢从Warburg效应转向氧化磷酸化，有效抑制结直肠癌细胞生长，增加ATP产生、诱导凋亡并降低细胞活力。衍生物2-6在DLD-1和HT29细胞中均表现出高特异性和细胞毒性，支持其作为体内应用的候选药物。该研究为靶向PTBP1的siRNA核酸药物在结直肠癌及其他肿瘤中的治疗应用提供了有力依据。
