小檗碱通过抑制WDR54/β-catenin信号通路抑制结直肠癌肿瘤生长

《Cell Biology International》：Berberine Inhibited Tumor Growth Through Suppressing the WDR54/β-catenin Signal Pathway in Colorectal Cancer

　　

小檗碱（Berberine，BBR）是一种天然生物碱，在结直肠癌（colorectal cancer，CRC）中表现出强效抗肿瘤活性，但其机制尚未完全阐明。对GEO数据集（GSE216908和GSE184414）的分析将WDR54确定为BBR治疗的关键靶点。在体外，BBR处理CRC细胞系（HT-29和SW480）显著抑制细胞增殖、DNA合成和集落形成。值得注意的是，BBR触发G1期细胞周期阻滞并促进凋亡，经流式细胞术和分子标志物分析验证。WDR54过表达部分挽救了这些抗肿瘤效应，证实了其功能重要性。在机制上，细胞热转移分析（cellular thermal shift assay，CETSA）和mRNA稳定性分析显示，BBR通过间接转录抑制而非直接蛋白结合或改变mRNA稳定性来抑制WDR54表达。双荧光素酶报告基因分析进一步证实，BBR剂量依赖性地抑制WDR54启动子活性。在体内，AOM/DSS诱导的CRC小鼠模型显示，BBR减少了肿瘤数量和大小，减轻了病理进展，并抑制了WDR54/β-catenin轴。这些发现表明，BBR通过下调WDR54和抑制Wnt/β-catenin信号传导在CRC中发挥显著抗肿瘤作用，突出了WDR54作为潜在治疗靶点以及BBR作为CRC治疗的有前景药物。

**论文解读：小檗碱通过抑制WDR54/β-catenin信号通路抑制结直肠癌肿瘤生长**

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球最常见且致命的恶性肿瘤之一，尽管手术、化疗和靶向治疗不断进步，晚期患者预后仍较差，亟需新的治疗策略。天然化合物因来源广泛、毒性低和抗肿瘤效应强而受到关注，其中小檗碱（Berberine，BBR）作为一种天然异喹啉生物碱，在乳腺癌、肝癌、肺癌等肿瘤中显示出抗肿瘤活性，并可通过AMPK、PI3K/AKT、mTOR、MAPK等信号通路发挥多靶点作用。然而，BBR调控CRC核心转录机制的具体上游分子开关仍不清楚。WDR54是一种含WD40重复结构域的蛋白，在T细胞急性淋巴细胞白血病、膀胱癌和CRC中被鉴定为癌基因，在CRC中高表达并与不良预后相关，但其是否可被天然化合物药理学靶向以及调控方式尚未明确。Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）通路是CRC进展中的重要信号通路。基于此，研究人员利用生物信息学与实验验证，旨在鉴定BBR在CRC中的新靶点并阐明其调控机制。该研究论文发表在《Cell Biology International》。

研究人员通过分析GEO数据集（GSE216908和GSE184414）鉴定出WDR54为BBR处理后的关键差异表达基因，并在CRC组织和细胞系中验证其高表达。体外实验表明，BBR处理显著抑制CRC细胞增殖、DNA合成和集落形成，诱导G1期阻滞和凋亡。机制研究表明，BBR并非直接结合WDR54蛋白，也不改变其mRNA稳定性，而是通过间接转录抑制WDR54启动子活性。功能实验显示，WDR54敲低可模拟BBR的抗肿瘤效应，而WDR54过表达部分逆转BBR的作用。体内AOM/DSS诱导的CRC小鼠模型进一步证实，BBR可减少肿瘤数量与体积，改善疾病参数，并抑制WDR54/β-连环蛋白轴。该研究首次揭示了BBR/WDR54/β-catenin调控轴，为CRC治疗提供了新靶点和候选药物。

**主要技术方法**：研究人员使用了来自GEO数据库的转录组数据集（GSE216908、GSE184414、GSE44076、GSE87211）进行差异表达基因分析和WDR54表达验证；采用CCK-8、BrdU掺入和集落形成实验检测细胞增殖；流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期；Western blot检测蛋白表达；分子对接、细胞热转移分析（CETSA）、放线菌素D mRNA稳定性实验和双荧光素酶报告基因实验解析调控机制；核质分离和放线菌酮（cycloheximide，CHX）追踪实验分析β-catenin稳定性；在AOM/DSS（氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠）诱导的CRC小鼠模型（C57BL/6小鼠，来自北京维通利华实验动物技术有限公司）中，通过免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）和免疫荧光（immunofluorescence，IF）评估WDR54和β-catenin表达。

**研究结果**：

**3.1 生物信息学鉴定WDR54为BBR的关键靶点**：通过分析两个独立GEO数据集的差异表达基因，发现22个基因在BBR处理后差异表达，其中WDR54显著下调。数据库和独立数据集验证显示WDR54在CRC组织和细胞系中高表达，且BBR处理可降低其mRNA水平。

**3.2 BBR通过转录抑制而非直接结合抑制WDR54表达**：分子对接虽提示BBR可与WDR54结合，但CETSA显示BBR未改变WDR54的热稳定性；放线菌素D实验显示mRNA半衰期不变；双荧光素酶报告基因实验显示BBR剂量依赖性地抑制WDR54启动子活性。由此证明BBR通过间接转录抑制下调WDR54。

**3.3 WDR54在AOM/DSS诱导的CRC小鼠模型中过表达，且敲低WDR54损害细胞增殖**：在模型小鼠结肠组织中WDR54表达升高；siRNA敲低WDR54后，CRC细胞增殖、BrdU掺入和集落形成均显著减少。

**3.4 WDR54沉默诱导细胞凋亡和G1期细胞周期阻滞**：流式细胞术显示WDR54敲低增加凋亡细胞比例并诱导G1期阻滞；Western blot显示Cyclin D1、Bcl-2、c-Myc和β-catenin下调；核质分离和CHX追踪实验表明WDR54敲低减少核内β-catenin并加速其降解。

**3.5 BBR靶向WDR54抑制CRC细胞生长和存活**：WDR54过表达可部分恢复BBR抑制的细胞增殖、DNA合成、集落形成，并减轻BBR诱导的凋亡和G1期阻滞，同时恢复相关蛋白表达，表明WDR54是BBR抗肿瘤作用的关键介导者。

**3.6 BBR在体内通过抑制WDR54/β-catenin轴抑制肿瘤生长**：在AOM/DSS模型中，BBR治疗显著减少肿瘤数量和体积，改善体重和疾病活动指数（disease activity index，DAI），减轻组织病理损伤；IHC和IF显示BBR降低WDR54和β-catenin的表达。

**讨论与结论**：讨论部分指出，该研究鉴定WDR54为BBR在CRC中的关键靶点，并扩展了既往对WDR54癌基因作用的认识。与膀胱癌中通过MEMO1调控β-catenin不同，本研究首次证明BBR通过间接转录抑制WDR54从而抑制β-catenin信号。虽然分子对接提示结合位点，但CETSA排除了直接结合；转录抑制是主要机制。研究局限性包括BBR的多效性、缺乏体内回补模型以及尚未鉴定具体转录因子。结论部分翻译：总之，该研究的结果将WDR54确定为BBR的新型可成药靶点，阐明了其在CRC进展中的关键作用。研究人员证明BBR通过间接转录抑制下调WDR54/β-catenin轴，导致G1期阻滞和凋亡。该工作不仅揭示了BBR的新分子机制，也突出了WDR54作为有希望的治疗脆弱点。未来研究需进一步阐明WDR54调控的分子决定因素、实验验证对接预测的结合模式，并在临床CRC标本中确认这些机制，以推动临床转化。