单细胞与Bulk转录组学鉴定与食管鳞状细胞癌免疫抑制相关的GNGT1高表达恶性上皮细胞

《Chemical Biology & Drug Design》：Single-Cell and Bulk Transcriptomics Identify GNGT1-High Malignant Epithelial Cells Associated With Immune Suppression in Esophageal Squamous Cell Carcinoma

　　

食管鳞状细胞癌（ESCC）具有上皮异质性和免疫抑制微环境特征，但临床相关的恶性上皮状态仍未被充分定义。研究人员整合了4个单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集和10个Bulk转录组队列，共1318例样本，并应用跨队列差异表达分析、生存分析以及包含113种算法组合的机器学习框架，筛选与恶性上皮细胞相关的生物标志物。GNGT1因其一致上调、预后相关性以及在ESCC中既往研究有限而被优先选择。在独立队列中，GNGT1表现出良好的诊断性能，而高表达与较差的总生存期和更晚的局部肿瘤状态相关。免疫去卷积分析一致地将GNGT1高表达肿瘤与CD8⁺ T细胞浸润减少、免疫评分降低以及细胞毒性T细胞标志物减少相关联。单细胞分析进一步将GNGT1高表达上皮细胞与涉及MIF、前列腺素和CXCL信号传导的上皮-免疫通讯改变相关联，同时富集上皮-间质转化、mTORC1和增殖程序；qPCR证实了ESCC细胞系中GNGT1表达升高。本研究将GNGT1定义为免疫抑制性恶性上皮状态的标志物，从而将上皮异质性与ESCC中的免疫重塑联系起来。这些发现支持GNGT1作为候选的诊断性、预后性和具有生物学信息的生物标志物，值得进行机制和临床验证。

食管鳞状细胞癌（ESCC）是常见的消化道恶性肿瘤，每年新发病例超过50万，近半数发生在中国。尽管手术、放疗、化疗和多模式治疗不断进步，但5年总生存率仍低于30%，主要原因是诊断延迟、复发或转移频繁以及现有治疗耐药。肿瘤微环境（TME）与ESCC进展和治疗反应密切相关，恶性上皮细胞通过复杂的细胞间网络与免疫细胞和基质细胞相互作用，塑造肿瘤生长、免疫逃逸和耐药性。单细胞RNA测序（scRNA-seq）能够高分辨率解析ESCC异质性，但恶性上皮细胞状态及其相关生物标志物仍未被充分表征，尤其是在上皮-免疫相互作用背景下。因此，整合单细胞转录组、Bulk转录组队列和机器学习辅助筛选可能有助于识别与ESCC恶性上皮细胞程序相关的生物学标志物。

研究人员整合了4个scRNA-seq数据集和10个Bulk转录组队列（共1318例样本），通过跨队列差异表达分析、生存分析和包含113种算法组合的机器学习框架，筛选恶性上皮细胞相关生物标志物。GNGT1因一致上调、预后相关性及在ESCC中研究有限而被优先关注。随后在多独立队列中验证其诊断和预后价值，并通过qPCR在细胞系中验证表达，同时进行免疫浸润、通路和细胞通讯分析，探索其与免疫微环境的关系。

主要技术方法如下：研究使用了公开数据库（GEO、TCGA、GTEx）中的单细胞和Bulk转录组数据，涵盖GSE196756、GSE188900、GSE53625、TCGA-ESCC、GSE23400、GSE38129等队列。单细胞分析采用Seurat流程，Harmony校正批次效应，UMAP聚类，并用inferCNV推断拷贝数变异以鉴定恶性上皮细胞。Bulk数据差异表达和单因素Cox回归筛选候选基因。机器学习框架包含12种基础算法（如LASSO、随机森林、SVM等）组成113种组合，以GSE53625为训练集，独立队列为验证集，通过ROC和AUC评估诊断性能。免疫浸润分析采用TIMER、CIBERSORT等6种算法。细胞通讯使用CellChat。通路富集使用GSEA、UCell和ssGSEA。qPCR验证细胞系表达。药物敏感性和分子对接为探索性分析。

研究结果如下：

3.1 单细胞转录组景观与恶性上皮细胞鉴定：整合两个scRNA-seq数据集（GSE196756和GSE188900），经批次校正后分析10个肿瘤和4个癌旁正常组织，UMAP聚类识别出21个细胞亚群，包括T细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等。上皮细胞再聚类得到6个亚群，通过inferCNV以T细胞为参考，确认所有上皮亚群具有显著更高的CNV分数，证实其恶性身份。差异表达分析显示，恶性上皮细胞与正常上皮细胞相比有1645个上调基因和223个下调基因。

3.2 整合Bulk和单细胞分析鉴定恶性上皮细胞相关生物标志物：在两个独立Bulk RNA-seq数据集（GSE194116和GSE235537）中进行差异表达分析，分别获得1300/1506和875/689个上下调基因。将两个数据集的上调基因与单细胞分析中恶性上皮细胞富集的1645个基因取交集，得到231个候选基因。GO和KEGG富集显示这些候选基因富集于细胞外基质（ECM）受体相互作用、IL-17信号、Toll样受体信号等通路。在GSE53625队列中对231个基因进行单因素Cox回归，筛出13个与总生存显著相关的基因。

3.3 机器学习辅助筛选候选生物标志物：基于13个预后相关基因，应用113种算法组合进行诊断模型构建。LASSO+朴素贝叶斯组合表现最佳，训练集GSE53625的AUC为0.977，验证集TCGA-ESCC、GSE23400、GSE38129的AUC分别为0.893、0.923和0.922。保留11个基因，Kaplan-Meier分析显示其中仅GNGT1和STRA6与生存显著相关。由于STRA6在多种癌症中已有广泛研究，而GNGT1在ESCC中研究有限，选择GNGT1作进一步分析。在TCGA-ESCC和GSE53625合并队列（n=273）中，高GNGT1表达组的总生存期显著较短。

3.4 多队列验证GNGT1表达、诊断性能和临床相关性：在TCGA-ESCC、GSE53625、GSE38129、GSE23400四个独立队列中，GNGT1在肿瘤组织中的表达均显著高于正常组织，AUC值从0.7到0.935不等，表明其具有良好的诊断判别能力。临床病理分析显示，GNGT1高表达组中T4期患者比例显著更高，提示其与更晚的局部肿瘤状态相关。qPCR检测显示，与正常食管上皮细胞HET-1A相比，ESCC细胞系TE1、TE13和KYSE150中GNGT1表达均升高，其中KYSE150最高（RQ=2.85–3.19）。

3.5 免疫浸润分析：基于GNGT1表达中位数将患者分为高低组，应用6种免疫浸润算法（TIMER、MCP-counter、CIBERSORT等）分析。所有算法均显示GNGT1高表达组CD8⁺ T细胞浸润显著降低。CIBERSORT分析表明GNGT1表达与CD8⁺ T细胞和M1巨噬细胞呈显著负相关，与单核细胞和树突状细胞呈正相关。免疫评分（ssGSEA、xCELL、ESTIMATE）均与GNGT1表达显著负相关。GNGT1表达与CD8A、GZMA、CCL5、IFNG等CD8⁺ T细胞标志物基因显著负相关，支持其与免疫抑制微环境相关。

3.6 治疗相关特征探索：在独立单细胞数据集GSE145370中，GNGT1在肿瘤上皮细胞中表达显著高于正常组织。在ESCC新辅助免疫化疗（NACI）队列GSE203115中，非响应者（NR）样本的GNGT1表达有高于响应者（R）的趋势，但因样本量极小（仅1例NR）只能作为初步观察。在ESCC新辅助放化疗队列GSE45670中，非病理完全缓解（npCR）组的GNGT1表达高于病理完全缓解（pCR）组。在直肠癌新辅助化疗队列GSE213331中，治疗前组表达最高，pCR组最低。在膀胱癌免疫治疗队列IMvigor210中，GNGT1高表达组预后较差，且SD/PD组表达显著高于CR/PR组。在黑色素瘤免疫治疗队列GSE100797中，高GNGT1表达与较差总生存相关，但响应组间无显著差异。这些探索性结果提示GNGT1可能与治疗抵抗有关，但需谨慎解读。

3.7 细胞通讯分析：在GSE145370原发ESCC队列中，CellChat分析显示GNGT1高表达上皮细胞与CD8⁺ T细胞、CD4⁺ Treg、巨噬细胞、成纤维细胞等具有广泛的预测相互作用。通路分析表明，GNGT1高表达上皮细胞是MIF信号的主要发送者，B细胞和巨噬细胞为主要接收者，且高表达MIF、ACKR3、CD74、CXCR4、CD44等配体受体。前列腺素信号通路中，GNGT1高表达上皮细胞为主要信号发送者，干扰素激活细胞和巨噬细胞为潜在接收者，PTGES2、PTGES3、PTGER4表达升高。在NACI队列GSE203115中，非响应组中GNGT1高表达上皮细胞通过CXCL信号主要与内皮细胞通讯，而响应组中巨噬细胞为CXCL主要发送者；前列腺素信号在非响应组主要靶向巨噬细胞，响应组靶向CD4⁺ Treg。

3.8 通路富集分析：GSEA显示GNGT1高表达组显著富集上皮-间质转化（EMT）（NES=3.26）、E2F靶点、G2M检查点、mTORC1信号等增殖相关通路；而干扰素γ反应、炎症反应、补体、TNF-α/NF-κB信号等免疫相关通路富集于低表达组。UCell和ssGSEA验证了GNGT1高表达上皮细胞中mTORC1、G2M检查点及氧化应激相关通路活性更高。这进一步支持GNGT1高表达与恶性肿瘤程序和免疫抑制相关。

讨论部分指出，GNGT1是异三聚体G蛋白γ亚基，生理情况下主要在视网膜光感受器表达，在正常食管上皮中几乎不表达，因此ESCC中的上调可能代表异位病理事件。免疫浸润和通路分析一致表明，GNGT1高表达与CD8⁺ T细胞减少和免疫抑制微环境相关。细胞通讯分析提示其可能通过MIF和前列腺素信号参与免疫逃逸。药物敏感性预测和分子对接提示GNGT1可能是潜在治疗靶点，但这些均为计算性结果。研究局限性包括：基于回顾性公开数据，缺乏前瞻性验证；GNGT1的因果作用未经实验证实；部分治疗队列样本量过小；免疫治疗分析在膀胱癌和黑色素瘤中进行，不能直接外推至ESCC。

研究结论部分翻译如下：本研究通过整合单细胞和Bulk转录组分析，将GNGT1确定为ESCC中恶性上皮细胞相关的候选生物标志物。GNGT1在ESCC组织和细胞系中上调，并与肿瘤-正常判别能力、较差总生存期、CD8⁺ T细胞浸润减少以及MIF/前列腺素相关上皮-免疫通讯改变相关。这些发现表明，GNGT1表达与ESCC中免疫抑制的恶性上皮状态相关。需要进一步的实验和临床验证以阐明GNGT1的功能作用和转化意义。