基于复相干函数的电调谐空间轴向剪切三维计算荧光显微镜重建图像质量优化

《Optics & Laser Technology》：Optimization of reconstructed image quality in 3D computational fluorescence microscopy with electrically tunable spatial axial shearing by complex coherence function

　　

研究人员研究了基于非相干数字全息术（IDH）中空间轴向剪切干涉的三维（3D）荧光显微镜系统中重建图像质量的优化，其中正交偏振分量之间的轴向剪切通过液晶透镜（LCL）电控。电调谐LCL提供动态剪切调整，提高了系统灵活性和对准稳定性。除了硬件实现，研究人员引入了一个相干引导优化框架，其中联合使用条纹可见度、图像对比度和重建信噪比（SNR）来确定最佳轴向剪切条件。使用荧光微球的实验表明，空间相干强度、信噪比（SNR）和3D重建性能之间存在强相关性。这些结果突出了空间相干性在非相干全息荧光成像中的核心作用，并将相干引导优化确立为稳健且准确的3D荧光重建的有效策略。

三维成像技术推动了生物医学、材料科学等领域的发展，但传统相干数字全息术受散斑噪声干扰，且需要相干参考光束，难以直接应用于荧光等低相干光源。非相干数字全息术（IDH）通过自干涉机制从空间部分相干光场中提取全息信息，然而现有IDH系统多采用固定光学配置，电调谐轴向剪切对干涉调制和重建质量的影响尚未系统研究。此外，基于定量相干度量的轴向剪切优化方法仍属空白。针对上述问题，研究人员展示了一种基于电调谐液晶透镜（LCL）的轴向剪切IDH显微镜架构，通过电压控制正交偏振分量间的轴向剪切，实现全分辨率四步相移重建，并引入基于条纹可见度、图像对比度和重建信噪比（SNR）的相干引导优化框架。实验证明，系统能够有效重建不同尺寸荧光物体的三维结构，并建立物体尺寸与最佳轴向剪切的线性经验关系。该研究为高鲁棒性、高精度的三维荧光重建提供了实用策略，论文发表在《Optics》。

研究人员为开展研究使用了以下主要关键技术方法：①空间轴向剪切干涉仪：基于4-f光学配置，将LCL置于傅里叶平面，对x偏振光施加二次相位调制，引入轴向剪切Δz = -f₁²/f_LCL，y偏振光不受影响；②四步相移技术：通过旋转偏振器P₂引入0、π/2、π、3π/2相移，记录四个全息图，提取条纹可见度g(Δz)和相位φ，得到复空间相干函数；③角谱传播法：将复相干函数反向传播，重建不同深度平面的荧光强度分布。样本来源包括荧光微球（Nile Red，直径1.94–11.1 μm）和PI染色小鼠脑核（尺寸5–10 μm），未涉及试剂培养或质粒构建。

**3.1. Experiment on Nile Red fluorescence bead**
使用473 nm激光激发荧光微球（直径3.42 μm），发射光经580 nm带通滤波器（10 nm带宽）增强时间相干性，50×物镜（NA 0.60）收集。通过记录四步相移全息图，研究人员重建了复相干函数的幅度（条纹可见度）和相位，并采用泊松方程解包裹相位。深度分辨重建显示，在z = 0 μm、-0.5 μm、-2 μm、-3.5 μm、-4.5 μm处均能观察到聚焦的微球图像，表明系统能实现三维深度重建。归一化强度剖面比较表明，重建聚焦微球与参考荧光图像具有良好一致性。

**3.2. Axial-shear optimization using LCL**
通过改变LCL电压（2 V、5 V、7 V），对应轴向剪切为0.427 μm、1.1306 μm、1.23 μm，研究人员分别评估了条纹可见度、图像对比度和重建SNR。在2 V时，条纹对比度仅0.491，SNR 18.07 dB，重建图像噪声大；5 V时对比度升至0.737，SNR达34.82 dB，重建质量最佳；7 V时对比度回落至0.491，SNR降至23.75 dB，表明过度剪切导致重建退化。针对不同直径荧光微球（1.94 μm、2.13 μm、3.42 μm、7.5 μm、11.1 μm），实验确定的最佳轴向剪切呈线性增长趋势，拟合关系为Δz_opt = 0.0142D + 1.088（D为微球直径，单位μm），表明较大物体需要更大剪切以获得最佳干涉调制。

**4. Experiments on biological sample (Mouse brain nuclei)**
针对PI染色小鼠脑核（发射峰值615 nm，带宽20 nm），采用6 V电压（对应轴向剪切约1.18 μm）。由于样本高密度且背景噪声强，原始全息图中条纹可见度低，传统荧光参考图像SNR仅0.3 dB。但通过四步相移处理，重建的复相干函数幅度显著抑制背景，重建图像SNR提升至6.7 dB，信噪比提高约20倍。深度分辨重建（z = -1 μm、0 μm、2 μm）清晰展示了不同深度的细胞核结构，验证了方法在复杂生物样本中的适用性。

总结讨论部分，研究人员指出LCL引入的残余像差可能影响重建质量，未来将探索计算像差校正策略（如数值波前补偿和数据驱动重建）。SLM实现可提供更大波前灵活性，但受刷新率和相位动态限制。当前四步相移方案为顺序采集，非单次成像，限制了动态过程应用。最佳轴向剪切与物体尺寸的依赖关系需通过更广泛样本验证，进一步工作将聚焦于单次实时成像（采用偏振敏感传感器）。研究结论翻译如下：
本研究研究了基于非相干数字全息术（IDH）并使用空间轴向剪切干涉和电调谐液晶透镜（LCL）的三维荧光显微镜系统中轴向剪切条件的优化。通过系统改变轴向剪切，研究人员利用条纹可见度、图像对比度和重建信噪比（SNR）作为评估指标，确定了不同尺寸荧光物体的最佳工作条件。实验确定的最佳值用于建立物体尺寸与轴向剪切之间的经验关系，为基于LCL的系统优化提供了实用指南。所提出的方法通过荧光微球和PI染色小鼠脑核进行了验证，展示了复相干函数的可靠提取和深度分辨荧光重建。尽管观察到的关系是在研究范围内经验获得的，但结果表明重建性能对轴向剪切条件存在系统依赖性。