《Pharmacological Research》：TEK downregulation Of LOX propeptide: A novel mechanism for endothelial cell protection following myocardial infarction
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血管内皮细胞在维持冠状动脉微血管的结构完整性和微循环功能中起着关键作用。内皮功能障碍是包括心肌梗死（MI）在内的多种心血管疾病的关键病理过程，由于血管壁内缺乏一氧化氮气体导致心肌血流量减少，最终引发炎症、血栓形成和冠状动脉阻塞。因此，识别保护内皮细胞损伤的分子
血管内皮细胞在维持冠状动脉微血管的结构完整性和微循环功能中起着关键作用。内皮功能障碍是包括心肌梗死（MI）在内的多种心血管疾病的关键病理过程，由于血管壁内缺乏一氧化氮气体导致心肌血流量减少，最终引发炎症、血栓形成和冠状动脉阻塞。因此，识别保护内皮细胞损伤的分子机制对于有效治疗MI是必要的。在本研究中，研究人员发现了TEK受体酪氨酸激酶（TEK）与信号转导及转录激活因子3（STAT3）之间的新型相互作用，促进STAT3的磷酸化和核转位。特别是，通过使用特异性STAT3结构域抑制剂抑制STAT3与TEK的结合，可以阻止STAT3和p-STAT3的上调。此外，染色质免疫沉淀（ChIP）分析显示，STAT3作为转录因子，结合到赖氨酰氧化酶（LOX）和LOX前肽（LOX-PP）的启动子区域，抑制其转录。值得注意的是，过量的LOX-PP已被证明可诱导内皮细胞损伤，导致一氧化氮合成减少、通透性增加，以及增殖、迁移和管形成功能受损。这些新发现揭示了心肌缺血后内皮细胞损伤的新机制，可能为开发未来的治疗方法提供新见解。
心肌梗死（MI）后，血管内皮细胞损伤是导致微循环障碍和心功能恶化的关键因素。内皮细胞通过分泌一氧化氮（NO）等物质维持血管功能，但缺血再灌注损伤会加速其结构和功能损伤，导致经皮冠状动脉介入治疗（PCI）或冠状动脉旁路移植术（CABG）后无复流现象。目前，保护内皮细胞损伤的分子机制尚不完全清楚。ANGPT1/TEK通路在血管新生中起重要作用，但其在内皮细胞保护中的作用尚未被充分探索。因此，研究人员旨在阐明ANGPT1/TEK通路在MI后内皮细胞保护中的新机制，该研究发表在《Pharmacological Research》。
研究人员通过体内外实验，利用基因敲除和过表达小鼠模型、细胞氧糖剥夺（OGD）模型，结合转录组学、蛋白质组学、免疫共沉淀（Co-IP）、染色质免疫沉淀（ChIP）等技术，发现ANGPT1激活TEK后，TEK直接与信号转导及转录激活因子3（STAT3）结合并促进其磷酸化和核转位，STAT3作为转录因子抑制赖氨酰氧化酶（LOX）和LOX前肽（LOX-PP）的转录，从而减少LOX-PP诱导的内皮细胞损伤。此外，LOX过表达导致细胞外基质（ECM）硬化，进一步破坏ANGPT1/TEK信号传导。
关键技术方法方面，该研究采用多种技术手段。动物实验使用他莫昔芬诱导的周细胞特异性ANGPT1敲除小鼠（Pdgfrb-Ang-1KO，购自南京大学-南京生物医学研究所）和腺病毒介导的ANGPT1/LOX过表达小鼠，并建立小鼠MI模型（左前降支结扎）。细胞实验使用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和人微血管周细胞（HMVPs，购自ScienCell Research Laboratories），建立OGD模型模拟缺血。采用转录组学（Illumina Novaseq 6000测序，由北京诺禾致源科技股份有限公司完成）和蛋白质组学（质谱分析）筛选差异表达基因和蛋白。通过Co-IP、GST pull-down和ChIP-qPCR验证蛋白相互作用和转录调控。功能实验包括管形成、球状发芽、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）增殖、Transwell迁移、粘附、NO和乳酸脱氢酶（LDH）测定等评估内皮细胞功能。
研究结果部分如下：
**3.1 周细胞与内皮细胞的相互作用随MI延长而减弱**：通过免疫荧光（IF）染色和细胞共培养模型，发现MI后周细胞（PDGFRB阳性）先于内皮细胞（PECAM1阳性）受损，随后周细胞被募集至梗死区，但内皮细胞在14天后显著减少。酶联免疫吸附试验（ELISA）和Western blot显示，ANGPT1蛋白表达先下降后回升，TEK应激性升高后下降，而ANGPT2持续上升。补充ANGPT1可延迟内皮细胞死亡，OGD建模时间设为24小时。
**3.2 周细胞特异性Angpt1敲除加重MI小鼠缺血损伤，而Angpt1过表达保护心功能**：Angpt1过表达增加视网膜血管密度，促进周细胞募集和内皮细胞存活，上调CDH5和VEGFA表达，改善心功能（射血分数EF和短轴缩短率FS），减少Nppb和NT-ProNppb水平，抑制纤维化。Angpt1敲除则加重上述损伤。
**3.3 调控ANGPT/TEK通路促进ANGPT1表达有利于抗缺氧损伤**：在共培养体系中，ANGPT1过表达增强内皮细胞管形成、球状发芽、迁移能力，促进CDH5和VEGFA表达，减少LDH释放，恢复NO产生，降低血管性血友病因子（VWF）并增加闭合蛋白5（CLDN5）表达，表明ANGPT1减轻内皮细胞损伤。
**3.4 ANGPT1/TEK通路激活导致LOX-PP和LOX表达下降**：转录组和蛋白质组筛选发现LOX变化最显著。OGD诱导LOX-PP早期升高（8小时），先于内皮细胞死亡（24小时），ANGPT1处理可逆转。体内外实验证实TEK激活与LOX-PP水平负相关，TEK减少成熟LOX分泌。
**3.5 LOX-PP过表达导致内皮细胞损伤**：通过敲低或过表达LOX-PP，发现LOX-PP水平与内皮细胞增殖、迁移、粘附、管形成能力负相关，与细胞损伤（calcein AM荧光降低、LDH释放增加）、通透性、VWF正相关，与NO和CLDN5负相关。BAPN（LOX酶活性抑制剂）不能改善损伤，提示LOX-PP通过非酶活性机制发挥作用，可能与成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）结合并抑制细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）和蛋白激酶B（AKT）磷酸化。
**3.6 ANGPT1激活的TEK磷酸化STAT3并促进其核转位**：OGD导致STAT3总蛋白和核内水平下降，与LOX升高时间点一致。ANGPT1激活TEK后恢复STAT3和p-STAT3水平，并促进其与TEK结合及核转位，该作用可被STAT3结构域抑制剂阻断。Co-IP、GST pull-down和皮尔逊相关系数定量共定位分析证实TEK与STAT3相互作用。
**3.7 STAT3通过抑制LOX转录保护内皮细胞损伤**：ChIP-qPCR证实STAT3结合LOX启动子，OGD增强结合，ANGPT1减弱结合，TEK抑制剂逆转。STAT3敲低消除ANGPT1对LOX-PP的抑制作用，并削弱ANGPT1对内皮功能的保护（管形成、迁移、NO、LDH、通透性）。
**3.8 LOX表达增加导致ECM硬化，阻碍ANGPT1/TEK信号传导**：MI后LOX增加，促进胶原I和III型交联，增加I型胶原吡啶交联末端肽（ICTP）水平，导致ECM硬化，Angpt1敲除加重此现象。ECM硬化减少周细胞-内皮细胞间通讯，降低TEK与ANGPT1结合。Lox过表达导致视网膜血管密度降低，心肌中TEK丢失。
讨论部分总结：该研究揭示了ANGPT1/TEK/STAT3/LOX-PP轴在MI后内皮细胞保护中的新机制。ANGPT1激活TEK，TEK与STAT3相互作用促进其磷酸化和核转位，STAT3抑制LOX转录，减少LOX-PP表达，从而减轻内皮细胞损伤。同时，LOX过表达导致ECM硬化，进一步破坏ANGPT1/TEK信号，形成恶性循环。研究还指出周细胞和内皮细胞损伤的异步性，以及ANGPT2/ANGPT1比例失衡的重要性。局限性包括使用HUVECs而非心脏微血管内皮细胞，缺乏临床样本验证，未考虑性别因素等。研究结论：LOX-PP介导心肌缺血后内皮细胞损伤，而TEK激活可抑制该现象；TEK通过结合STAT3促进其磷酸化和核转位，抑制LOX转录，减少LOX-PP诱导的内皮功能障碍。
