神经发育障碍中PV神经元可塑性的促认知恢复

《Nature》：Procognitive restoration of PV neuron plasticity in neurodevelopmental disorders

　　

海马体在共活化的锥体神经元（PNs）群体中形成我们经历的 memories^1,2,3。齿状回–CA3/CA2回路中的快速放电、表达小清蛋白的抑制性中间神经元（PV INs）通过苔藓纤维依赖的前馈抑制精确控制 PN 活动^{4,5,6,7,8,9,10,11}。PV INs 协调其内在兴奋性、突触连接性、生理学和可塑性特性的经验依赖性变化^{9,12,13,14,15}（此处称为经验依赖性 PV IN 可塑性），以调节 PN 活动。在生命早期，当神经回路对经验高度敏感时，PV IN 损伤被认为会导致网络过度兴奋、癫痫发作和认知障碍，这些是神经发育障碍（NDDs）的标志^16,17,18。在此，研究人员设计了一种输入特异性转译组筛选，以鉴定成年海马 CA3/CA2 亚区中经验依赖性 PV IN 可塑性基因（XPGs）的调节因子。研究人员证明，上调的候选 XPGs 中有相当一部分在自闭症谱系障碍、癫痫、双相情感障碍和精神分裂症中表现出单倍剂量不足，这表明 NDDs 中存在受损的经验依赖性 PV IN 可塑性。在概念验证实验中，在成年 NDD 风险小鼠模型的 CA3/CA2 PV INs 中靶向上调候选 XPG——同源盒基因 Meis2（参考文献 19），足以恢复经验依赖性 PV IN 可塑性。此外，神经元集群和尖波涟漪（SWR）特性以及认知得到改善，癫痫发作被抑制。因此，经验依赖性 PV IN 可塑性是 NDD 风险基因的汇聚机制，可以在成年期被重新建立，以逆转回路、网络兴奋性和认知的发育缺陷。

**论文解读：经验依赖性PV中间神经元可塑性——神经发育障碍的汇聚机制与靶向恢复**

**研究背景与问题**
海马体在记忆形成、存储和提取中发挥关键作用，通过经验依赖的方式校准动机和防御行为。出生后早期，经验塑造海马回路，影响认知轨迹。海马回路紊乱会导致适应不良的神经回路功能、认知障碍和癫痫发作，这些是自闭症谱系障碍（ASD）、双相情感障碍、精神分裂症和癫痫等神经发育障碍（NDDs）的特征。海马齿状回（DG）–CA3/CA2回路中的快速放电、表达小清蛋白的抑制性中间神经元（PV INs）通过活动依赖的锥体神经元（PNs）胞体周围抑制，调控记忆的编码、存储、提取和路由。PV INs 介导的前馈抑制决定了 PN 的放电、PN 同步化形成神经元集群以及网络振荡的产生，从而调节海马-皮层-皮层下网络内的沟通。为发挥这些作用，PV INs 以细胞自主方式协调其内在特性、轴突分支和胞体周围突触的结构重组、前馈抑制的调节以及突触可塑性的经验依赖性变化，这些特性统称为经验依赖性 PV IN 可塑性。在NDDs中，PV IN功能的丧失可能源于遗传风险因素，这些因素损害了出生后早期PV IN介导的抑制的经验依赖性精化。然而，调控成年海马PV IN特性的发育调节因子，以及控制成年海马中经验依赖性PV IN可塑性的转录因子和表观遗传调节因子，其证据仍然匮乏。

**研究目的与假设**
本研究旨在：1）通过输入特异性转译组筛选，鉴定成年小鼠CA3/CA2 PV INs中响应苔藓纤维输入增加而上调的经验依赖性PV IN可塑性基因（XPGs）；2）验证这些XPGs是否编码NDD和癫痫的超高置信度风险基因；3）检验在广泛使用的NDD风险小鼠模型（Cntnap2^–/–小鼠）的成年海马中恢复经验依赖性PV IN可塑性，是否足以逆转发育缺陷，包括回路异常、神经元集群特异性、尖波涟漪（SWR）特性、癫痫发作和认知障碍。

**主要关键技术方法**
1. **输入特异性转译组筛选**：利用慢病毒表达靶向Ablim3的短发夹RNA（shRNA）下调DG苔藓纤维中的ABLIM3（一种苔藓纤维丝状伪足与PV IN连接性的分子制动器），模拟经验引起的苔藓纤维输入增加。结合PVcre;Rpl22HA^HA/HA小鼠（允许从PV INs中特异性分离核糖体相关mRNA），通过抗HA磁珠免疫沉淀，比较静息状态与激活状态下CA3/CA2 PV INs的转译组，鉴定差异表达基因。
2. **病毒介导的基因表达**：利用S5E2增强子驱动的AAV载体或Cre依赖的AAV-DIO系统，在CA3/CA2 PV INs中特异性过表达候选XPG（如Meis2、Tbr1等）。
3. **离体全细胞膜片钳记录**：记录CA2 PNs和PV INs的自发/微小兴奋性及抑制性突触后电流（sEPSC/sIPSC、mEPSC/mIPSC）、光遗传或电刺激诱发的突触电流、内在兴奋性以及抑制性长时程抑制（iLTD）。
4. **行为学测试**：包括新物体位置任务（NOL）、社交识别与辨别任务、旷场实验、新物体识别任务，以及基于SLEAP的家笼群体社交行为分析。
5. **体内电生理记录**：在CA1区进行局部场电位（LFP）记录，检测非快速眼动睡眠（NREM）期间的SWR特性；在皮层进行长期皮层电图（ECoG）记录，监测自发性癫痫发作。
6. **神经元集群标记**：使用Cal-Light系统，在社交互动期间标记活跃神经元，随后评估集群重激活率。
样本来源：所有实验使用Cntnap2^–/–小鼠及其野生型同窝对照，以及PVcre、Amigo2cre、Rpl22HA等转基因小鼠，均购自Jackson Laboratory。

**研究结果**

**1. CA3/CA2 中 XPGs 的发现**
通过输入特异性转译组筛选，研究人员在成年小鼠CA3/CA2 PV INs中鉴定出82个与SFARI数据库ASD 1类和S1类基因相关的显著上调候选XPGs，以及精神分裂症、双相情感障碍相关基因。基因集富集分析显示这些XPGs参与突触生理、结构重塑和突触前末端特化。值得注意的是，半数ASD相关上调XPGs也涉及癫痫。qPCR验证了Meis2、Bcl11a、Tbr1和Herc1的上调。S5E2增强子驱动这些XPGs在PV INs中的表达可增加CA3/CA2 PN上的PV IN突触。Meis2在CA2 PN中的过表达对PV IN突触无影响，表明其作用依赖于PV IN本身。

**2. Cntnap2^–/– 小鼠 PV IN–PN 突触减少**
成年Cntnap2^–/–小鼠CA3/CA2 PV IN胞体周围突触密度低于野生型，且社会经验无法诱导其增加。社会经验可诱导野生型小鼠CA3/CA2 PV IN中Meis2转录本和蛋白表达上调，但Cntnap2^–/–小鼠中无此效应。

**3. S5E2-Meis2 恢复 PV IN–CA2 传递**
在成年Cntnap2^–/–小鼠CA3/CA2 PV INs中表达Meis2（通过S5E2或PV-Cre靶向策略）可恢复PV IN胞体周围突触密度。电生理记录显示：Cntnap2^–/–小鼠CA2 PNs的sEPSC频率和振幅升高、sIPSC频率降低、mEPSC频率升高；Meis2表达逆转了这些异常，降低了sEPSC频率和振幅，增加了sIPSC频率，并恢复了mIPSC频率和振幅。在PV IN中，Meis2表达逆转了sEPSC频率的升高，并增加了mEPSC振幅。光遗传诱发的苔藓纤维驱动电流显示，Cntnap2^–/–小鼠EPSC振幅升高、IPSC振幅降低，E/I比值增大；Meis2表达使这些参数恢复至野生型水平。此外，Cntnap2^–/–小鼠PV IN内在兴奋性降低，Meis2表达恢复了兴奋性并降低了基电流阈值。Meis2还恢复了苔藓纤维驱动的抑制性长时程抑制（iLTD）。对照实验表明，S5E2增强子主要靶向PV INs，而非CA2 PNs，且Meis2在非PV中间神经元中的过表达不影响PV IN功能。Tbr1在PV INs中的表达也部分恢复了突触传递，但未改变PV IN兴奋性，提示不同XPGs具有差异调控作用。

**4. PV-Cre 靶向 Meis2 挽救 PV IN–CA2 传递**
通过遗传-时间策略（PVcre;Cntnap2^–/–小鼠结合AAV-DIO-Meis2）独立验证了上述结果：Meis2在PV-Cre靶向的CA3/CA2 PV INs中表达同样逆转了sEPSC、sIPSC、mEPSC、mIPSC的异常，并恢复了光遗传诱发的E/I平衡。

**5. Meis2 挽救 Cntnap2^–/– 小鼠的认知功能**
S5E2-Meis2或PV-Cre-Meis2表达均挽救了Cntnap2^–/–小鼠在新物体位置任务中的记忆缺陷，以及社交识别与社交辨别任务中的障碍。旷场实验、新物体识别和家笼社交行为（SLEAP分析）未见组间差异。Cal-Light标记实验显示，Meis2表达增加了社交刺激相关神经元集群的重激活率，表明集群特异性增强。CA1区SWR记录发现，Cntnap2^–/–小鼠在社交互动后NREM睡眠期间的SWR频率、峰值振幅、涟漪功率和持续时间均降低，Meis2表达恢复了这些参数。

**6. Meis2 减少 Cntnap2^–/– 小鼠的癫痫发作**
在成年Cntnap2^–/–小鼠中，S5E2-Meis2表达4-5个月后，ECoG记录显示，对照组14只小鼠中有10只出现自发性癫痫，平均每天1.83次；而Meis2组12只小鼠中仅3只出现癫痫，平均每天0.15次，癫痫发作频率显著降低，且发作小鼠比例减少。野生型小鼠中未见癫痫发作。

**7. MEIS2 调控 PV IN 可塑性基因**
qPCR分析显示，在PV IN中过表达Meis2上调了多种转录因子（Bcl11a）、离子通道调节因子（Kcnab1）、突触粘附和信号蛋白（Kirrel3、Cdh2、Dcc、Reln、Tanc1）、染色质重塑因子（Chd7）以及PV IN特异性突触囊泡蛋白Syt2的mRNA水平。

**讨论与结论**
本研究发现，经验依赖性PV IN可塑性是NDDs（包括ASD、双相情感障碍和精神分裂症）中认知障碍和癫痫发作的汇聚生物学机制。通过输入特异性筛选，研究人员鉴定出一批在PV INs中响应经验而上调的XPGs，其中相当一部分为NDD风险基因，提示这些基因的单倍剂量不足导致PV IN可塑性受损。在Cntnap2^–/–小鼠模型中，成年期恢复Meis2在CA3/CA2 PV INs中的表达，足以逆转发育性的兴奋-抑制失衡、认知缺陷和癫痫表型。MEIS2可能通过作为许可性共激活因子，与其他转录因子和染色质重塑因子协同作用，指导经验依赖性PV IN可塑性的不同方面。研究还表明，不同XPGs（如Meis2和Tbr1）差异性地调控PV IN兴奋性和突触可塑性。结论：经验依赖性PV IN可塑性是NDD风险基因的汇聚机制，在成年期恢复该可塑性为缓解NDD认知障碍和减少癫痫发作提供了治疗干预机会。这一前馈抑制基序在支持感觉处理、记忆、认知灵活性、决策和注意力的回路中普遍存在，靶向经验依赖性PV IN可塑性可能影响NDD的不同认知领域。