综述：从兼性景天酸代谢植物冰叶日中花中学习：气候智慧型农业的分子机制

《Plant Physiology and Biochemistry》：Learning from Facultative CAM Plant Mesembryanthemum Crystallinum: Molecular Mechanisms for Climate-Smart Agriculture

　　

全球人口增长和频繁的干旱事件对农业可持续性构成重大挑战，迫切需要开发具有增强胁迫适应性和水分利用效率（WUE）的作物。景天酸代谢（CAM）是一种特殊的碳同化途径，通过昼夜节律性的气孔关闭和夜间CO₂固定来提高植物的耐旱性和水分利用效率。兼性CAM物种冰叶日中花（Mesembryanthemum crystallinum）已成为研究盐胁迫或干旱胁迫下从C₃光合作用到CAM可逆转换的关键模型。C₃-to-CAM转换是一个高度可塑且协调的过程，受环境信号、昼夜节律调控、激素信号和代谢重编程的整合调控，导致碳代谢、液泡运输和细胞能量状态的广泛重塑。在本综述中，研究人员综合了目前对冰叶日中花中C₃-to-CAM转换的理解，重点阐述了调控机制和近期组学驱动的见解。研究人员还强调了新兴的研究方向，包括磷酸化蛋白质组学、单细胞方法和功能基因组学，这些对于推进CAM生物学以及赋予C₃作物CAM可塑性以提高其抗旱性和恢复能力至关重要。

1. 引言
全球环境变化以气温升高、降水格局改变和干旱加剧为特征，对水资源、农业生产力和粮食安全产生重大影响。同时，人口增长加剧了淡水资源和粮食生产的压力。提高作物胁迫韧性和水分利用效率已成为主要研究重点。光合作用是植物将光能转化为化学能的基础生物学过程，驱动大气CO₂固定为有机化合物。理解和利用自然进化的光合适应策略是开发气候智慧型作物的有前景途径。景天酸代谢（CAM）通过碳固定和同化的时间分离来优化水分利用效率，在缺水条件下具有显著适应性价值。CAM植物在夜间开放气孔，通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）固定CO₂生成草酰乙酸，随后以苹果酸形式储存于液泡中；白天气孔关闭以减少水分损失，苹果酸脱羧释放CO₂供C₃光合作用使用。兼性CAM植物能够在环境胁迫下可逆地从C₃转换到CAM，为解析光合可塑性的调控机制提供了有力工具。冰叶日中花是研究C₃-to-CAM转换生理、生化和分子方面的最佳模式系统之一，其转换快速、可逆且可在实验室条件下控制。

2. 冰叶日中花中C₃-to-CAM转换的环境和发育调控
C₃-to-CAM转换最初于20世纪70年代初在冰叶日中花中被发现由盐胁迫诱导。盐度和干旱是CAM诱导的主要触发因素，其他因素如低湿度、外源脱落酸（ABA）和营养缺乏也可诱导CAM。连续CO₂交换测量表明，CAM诱导受环境胁迫而非发育程序控制，但幼年期植物（3周龄）不具备在盐胁迫下诱导CAM的能力，表明其缺乏启动CAM程序所需的分子机制或信号受体。植物成熟后（6周龄），盐胁迫可强烈激活PEPC1转录并引发CAM转换。因此，冰叶日中花必须达到允许的个体发育阶段才能具备进行C₃-to-CAM转换的能力。

3. 冰叶日中花C₃-to-CAM转换期间的解剖和细胞特化
解剖和细胞特化对CAM诱导很重要。悬浮细胞无法诱导CAM，表明CAM诱导需要细胞培养中缺失的组织结构或自养程序。叶片厚度、肉质化、叶肉细胞增大和细胞间隙减少等解剖特征通常与CAM光合作用相关，尤其是在支持液泡苹果酸储存、水分储存和内部CO₂再利用方面。然而，叶片解剖与CAM功能之间的关系并非普遍存在，在不同进化谱系和CAM生理型中有所差异。液泡研究表明，盐诱导的CAM与叶肉细胞中两种功能不同的液泡类型形成相关：酸性液泡用于苹果酸储存，密度更高且酸性较低的液泡专门用于Na⁺隔离。新兴证据表明，CAM不仅由叶肉细胞驱动，还需要多种细胞类型的协调变化，包括保卫细胞。冰叶日中花的保卫细胞表现出类似CAM的代谢和转录重编程，实现气孔节律的逆转并提高WUE。盐胁迫过渡期间，41个保卫细胞相关蛋白被发现差异磷酸化，包括富含甘氨酸的RNA结合蛋白7（GRP7）和ABI5结合蛋白1（AFP1），它们可能分别在夜间气孔开放和日间气孔关闭中发挥重要作用。

4. CAM诱导期间的代谢重编程
4.1. 碳代谢的昼夜协调
CAM的建立需要初级代谢的大规模重组，以促进碳固定和同化的时间分离。PEPC酶活性在CAM诱导期间增加45倍，PEPC成为CAM诱导的标志。PEPC调控发生在多个层面，包括转录上调、从头蛋白合成增强以及通过PEPC激酶（PPCK）进行的翻译后修饰。夜间淀粉降解为PEPC活性提供磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），而日间淀粉合成补充碳储备。碳水化合物不仅作为代谢底物，还作为调控信号调节CAM基因表达和酶活性。

4.2. 亚细胞区室化、代谢物运输和渗透调节
CAM诱导需要胞质酶、叶绿体酶和线粒体酶的精确亚细胞定位，以实现夜间CO₂固定和日间脱羧的时间分离。叶绿体代谢物运输在CAM诱导期间被广泛重编程。日间碳通量依赖磷酸烯醇式丙酮酸磷酸转运体和葡萄糖-6-磷酸磷酸转运体（GPT）的PEP输出和葡萄糖-6-磷酸输入，而夜间淀粉动员使用多种运输途径。液泡膜的结构和功能重塑包括V型ATP酶活性的增加和亚基组成的改变，其产生电化学梯度以驱动夜间苹果酸积累。磷酸化蛋白质组数据显示液泡膜定位蛋白（包括V-ATP酶亚基和候选转运体）存在动态磷酸化变化，表明翻译后调控可能微调质子泵活性和液泡膜上的代谢物运输。然而，冰叶日中花中的液泡苹果酸通道/转运体尚未被表征。CAM诱导还涉及离子稳态的显著变化，盐胁迫下大量Na⁺和Cl^-被隔离在液泡中，同时脯氨酸和松醇等相容性溶质的积累有助于渗透调节和细胞保护。

5. 光合电子传递和叶绿体能量学
尽管C₃-to-CAM转换通常从碳代谢角度考量，但光合电子传递和叶绿体能量学在CAM诱导期间也受到动态调控。冰叶日中花的核心光合装置在胁迫诱导转换期间基本保持完整。质体醌（PQ）库氧化还原状态的变化和活性氧（ROS）的产生对CAM诱导和胁迫响应都至关重要。盐诱导的CAM与活性PQ库的增强还原和扩张相关，增加了胁迫下的电子传递能力。CAM诱导涉及叶绿体代谢和能量平衡的转变，包括电子流和ATP/NADPH产生的调整，表明光合机制在胁迫下并未下调，而是被微调以满足CAM特异的代谢需求和胁迫适应。

6. CAM诱导期间信号网络的整合
6.1. 昼夜节律信号
昼夜节律在CAM夜间羧化和日间脱羧的时间分离中发挥核心作用。调控PEPC的激酶PPCK被证明不依赖Ca²⁺且受昼夜节律控制。冰叶日中花中央昼夜节律钟在盐胁迫和CAM诱导下高度保守且稳定，表明CAM通过时钟输出的重连而非新型CAM特异性振荡器的进化来调控。关键质体和线粒体代谢物转运体GPT2和DCT1也受昼夜节律控制。

6.2. 激素信号
激素在CAM诱导中似乎作为调节因子而非主要信号。外源ABA可通过增加关键CAM酶的合成来诱导CAM。近期磷酸化蛋白质组数据表明，ABA信号与CAM期间气孔运动的昼夜调控相关，尤其是促进日间气孔关闭。ABA响应蛋白包括AFP1、氧化胁迫3（OXS3）和E3泛素连接酶PUB11在C₃-to-CAM转换期间表现出动态磷酸化变化。其他激素的参与尚不清楚。

6.3. 钙和ROS信号
钙螯合阻断CAM诱导，而钙升高诱导PEPC1，表明胞质Ca²⁺浓度升高可能参与CAM诱导。ROS是诱导CAM相关基因的重要信号，但单独ROS不足以触发CAM。Ca²⁺信号由钙依赖性蛋白激酶（CDPKs）转导，将Ca²⁺内流与下游磷酸化事件联系起来。冰叶日中花中一种胁迫诱导的CDPK在盐胁迫和水分亏缺下经历自磷酸化和动态亚细胞重定位。CDPK介导的双组分假响应调节因子磷酸化提供了Ca²⁺信号与转录调控之间的直接联系。为应对升高的ROS，植物激活酶促和非酶促抗氧化系统以保护细胞免受氧化损伤。

7. 基因调控机制：转录、转录后和表观遗传调控
冰叶日中花的C₃-to-CAM转换不受单一主控基因控制，而是涉及多个调控层面协调的基因表达广泛重编程。CAM诱导与碳代谢关键酶转录本丰度的快速显著增加相关，包括PEPC1、PPDK和PGM1，表明转录激活是CAM诱导的标志。这些变化高度动态，转录水平对盐胁迫快速响应并在胁迫解除后下降，表明CAM基因表达在冰叶日中花中既可诱导又具可逆性。盐胁迫激活超过18个特异性转录因子，协同调控ABA相关基因和CAM相关代谢基因。盐诱导的PEPC1启动子区域含有保守的Myb样结合基序，与盐胁迫植物的核提取物形成DNA-蛋白质复合物。转录后机制也参与CAM诱导期间基因表达的微调。盐胁迫下，冰叶日中花通过延长3'UTR稳定叶绿体RNA结合蛋白的特定mRNA异构体，实现转录本积累而不增加转录。盐或冷胁迫引起磷酸核酮糖激酶mRNA的瞬时转录后减少而不影响蛋白丰度，表明核心光合机制在CAM诱导期间受到缓冲。液泡H⁺-ATP酶的表达在转录和转录后水平均受到亚基特异性调控。多种质膜和液泡膜水通道蛋白的蛋白丰度存在昼夜变化，与转录水平解偶联，但与水通透性和细胞渗透性的振荡平行。miRNA介导的转录后调控使冰叶日中花能够在盐胁迫下利用Na⁺作为功能性渗透离子。碳水化合物依赖的转录后机制调控CAM代谢的昼夜协调。表观遗传调控也发挥重要作用。盐诱导的CAM伴随CpNpG DNA甲基化增加两倍，靶向卫星DNA，表明CAM诱导涉及全局染色质重构。PEPC1启动子上的胞嘧啶甲基化在C₃-to-CAM转换期间发生。RING型copine 1是一种盐诱导的膜相关E3泛素连接酶，与特定E2酶选择性配对并与细胞核中的argonaute 4相互作用，提示其在盐胁迫期间重塑表观遗传基因调控中的作用。

8. 翻译后调控：蛋白质磷酸化的作用
蛋白质磷酸化是一种可逆的翻译后修饰（PTM），在调控植物细胞信号通路、酶活性和代谢通量中发挥关键作用。CAM中一个特征明确的调控范式是PEPC被PPCK磷酸化并被蛋白磷酸酶2A去磷酸化，发生在PEPC N端附近一个保守的丝氨酸残基（冰叶日中花中的pS11），导致对苹果酸反馈抑制的敏感性降低。盐和干旱胁迫激活CDPK1，其进入细胞核并磷酸化CDPK底物蛋白1（一种DNA结合调控蛋白），支持胁迫诱导的Ca²⁺瞬变通过磷酸化调控核蛋白以重编程基因表达的模型。冰叶日中花中鉴定出多个蛋白磷酸酶2C基因，其表达表现出强烈的昼夜和昼夜节律调控，并在盐诱导的CAM后增强。近期磷酸化蛋白质组分析显著扩展了C₃-to-CAM转换的已知磷酸化调控图谱，鉴定了4,758个磷酸化位点中的4,233个磷酸化肽段，直接体内证实了PEPC1在Ser11的磷酸化，并揭示大量蛋白表现出相似的昼夜磷酸化模式，表明存在夜间CAM诱导磷酸化网络。其中，囊泡运输组分的物理相互作用网络经历动态磷酸化，表明C₃-to-CAM转换涉及细胞内运输和囊泡运输的结构协调重组。糖酵解/糖异生和碳储存/分解模块中的CAM酶在转换期间被广泛磷酸化。GRP7与冷休克蛋白1关联被鉴定为可能协调夜间气孔开放的潜在转录开关，而日间气孔关闭则涉及复杂信号整合，包括ABA信号AFP1和OXS3的激活，以及蓝光信号和高内部CO₂响应的抑制。

9. CAM诱导的系统水平视角
高通量组学技术的应用将C₃-to-CAM转换的理解从以酶为中心模型转变为多水平调控网络。大规模EST和微阵列分析揭示了CAM诱导期间广泛的昼夜节律调控基因表达重编程，包括CAM相关碳代谢、碳水化合物周转、运输、胁迫响应和信号基因的协同上调，同时抑制C₃光合作用和生长相关途径。然而，这些早期大规模图谱主要是稳态比较。蛋白质组学研究强调了液泡H⁺-ATP酶亚基的重要性，其化学计量和丰度在CAM诱导期间被重塑。盐处理后，冰叶日中花的C₃-to-CAM转换被确定在三天内发生。分离保卫细胞的转录组分析表明这些特化细胞经历自主的CAM相关分子重编程，改变近500个差异表达转录本。高质量冰叶日中花基因组的组装加速了从发现型组学向功能和进化基因组学的转变。在进化过程中，冰叶日中花基因组经历了染色体重排和基因丢失。这些基因组资源为控制C₃-to-CAM转换的潜在分子开关提供了新见解，并为未来CAM工程提供了基础蓝图。

10. CAM工程的进展和挑战
将CAM工程化到C₃物种中需要全面理解C₃、CAM和CAM诱导机制。理想的CAM工程是开发“按需CAM”作物，在水分受限条件下最小化水分损失而不牺牲正常供水条件下的光合性能和产量。兼性CAM物种冰叶日中花因其可逆的C₃-to-CAM转换而成为最有价值的模式系统。早期工程努力集中在在拟南芥中表达单个冰叶日中花CAM羧化/脱羧循环基因，但单个基因的表达不足以产生CAM样表型，表明CAM是一个整合的调控网络而非独立代谢酶的集合。工程策略已转向系统水平方法，采用迭代设计-构建-测试-学习（DBTL）循环。近期在水稻中实现了合成兼性CAM旁路的开发，通过转基因堆叠系统整合密码子优化的夜间羧化和苹果酸运输模块，工程水稻在田间条件下生物量和籽粒产量增加约20%，但未观察到WUE和耐旱性的改善，表明仅重建碳代谢不足以复制CAM的全部生理益处。Lim等人提出将CAM重建为相互连接的功能模块，包括羧化、脱羧、储存碳水化合物生物合成/降解、线粒体三羧酸循环、气孔控制和昼夜节律控制，多基因模块的协调表达比单基因工程产生更大的生理益处。然而，将完全功能的CAM途径工程化到C₃作物中仍具挑战性，因为CAM是高度整合的生理性状而非代谢酶的集合。主要挑战包括对CAM诱导分子机制的不完全理解、液泡苹果酸运输和日间苹果酸外流的关键过程尚不清楚、以及重建CAM特有的空间和时间调控的困难。此外，CAM性能依赖于解剖适应，如增大液泡、叶片肉质化和高叶肉细胞密度，单纯代谢工程可能无法复制所有CAM特征。

11. 结论
冰叶日中花中的C₃-to-CAM转换是一个发育门控、胁迫诱导、高度协调且动态的过程，涉及环境感知、代谢重编程、多种信号整合和多层调控控制。关键挑战包括提高对CAM解剖要求的理解、鉴定液泡转运体及其昼夜苹果酸动员调控、利用单细胞和空间组学解析细胞类型特异性和亚细胞动态、以及鉴定CAM相关磷酸化动态的上游激酶和磷酸酶。多数研究集中于盐诱导的CAM，干旱诱导的CAM是否依赖重叠或不同的调控机制尚不清楚。CAM本质上是一种单细胞现象，所有CAM酶与C₃物种中的祖先形式同源，表明生化相容性。兼性CAM物种的存在也表明C₃和CAM在有机体水平上的相容性，使CAM工程化到C₃物种成为现实。未来工作应优先对这些候选基因进行系统功能验证和调控网络重建。新兴技术如单细胞转录组学和蛋白质组学、空间组学、染色质可及性分析（如ATAC-seq）和DNA-蛋白质相互作用图谱（如DAP-seq）为解析细胞类型特异性调控和鉴定关键转录及表观遗传调控因子提供了有力方法。CAM工程仍处于早期阶段，多组学、功能基因组学和合成生物学的最新进展已显著加深了对CAM诱导调控网络的理解，持续整合这些方法将加速调控网络的发现，并为工程化气候韧性的“按需CAM”作物提供分子蓝图。