棉花GhFEI1基因抗黄萎病功能分析

《Plant Stress》：Functional analysis of GhFEI1 gene in cotton resistance to Verticillium wilt

　　

大丽轮枝菌（Verticillium dahliae，V. dahliae）是最具破坏性的土传病原真菌之一，严重降低棉花产量与纤维品质。开发转基因抗性材料可为增强抗逆性棉花育种提供优异种质资源。研究人员在陆地棉、海岛棉、拟南芥和水稻4个物种中共计鉴定出230个FEI家族成员。FEI家族蛋白含有PLN00113和LRR（leucine-rich repeat，富含亮氨酸重复序列）结构域。启动子区域检测到多个与水杨酸（salicylic acid，SA）、甲基茉莉酸（methyl jasmonate，MeJA）及防御反应相关的顺式作用元件。通过农杆菌介导遗传转化获得3个GhFEI1过表达棉花株系。田间表型评价显示转基因株系与野生型品种冀棉14（Jimian 14）在农艺性状、纤维品质或产量上无显著差异，筛选出最优株系GhFEI1-OE2。室内抗性测定表明，与对照组相比，转基因株系病指、真菌生物量、维管褐变及真菌回收能力均显著降低。形态学观察显示GhFEI1过表达促进根系发育，包括根伸长与分支能力增强。转录组分析进一步表明，GhFEI1通过调控茉莉酸（jasmonic acid，JA）信号通路与木质素生物合成正向调节棉花对V. dahliae黄萎病的抗性。本研究为GhFEI1在棉花抗病功能研究与育种应用中的遗传资源和理论参考提供了依据。

研究背景方面，棉花作为全球纺织业战略作物，全生育期受黄萎病（由V. dahliae引起的土传维管束病害）严重威胁，目前大面积推广的陆地棉品种中稳定高抗资源稀缺，化学药剂防控效果有限且破坏土壤微生态，因此挖掘功能明确的抗病基因并创制新种质是育种优先方向。已有研究提示FEI信号通路在拟南芥中与漆酶介导的木质素聚合相关，而棉花中FEI家族是否参与对土传真菌的免疫调控尚属空白。研究人员以陆地棉冀棉14为受体，开展GhFEI1功能验证：通过生物信息学鉴定FEI家族、预测结构与启动子元件，利用农杆菌介导转化构建GhFEI1过表达株系（T₁–T₃代），结合田间与室内接种Vd991（Race 2高毒力菌株）评价抗病性，并采用qRT-PCR、转录组测序、根扫描及真菌生物量/回收检测解析机制。论文发表于《Plant Stress》。

关键技术方法上，研究人员从公共数据库获取四物种基因组以鉴定FEI家族并构建系统树与motif；以TM-1转录组分析根组织表达；经BP/LR重组将GhFEI1 CDS接入pK2GW7.0在冀棉14中过表达，T₃纯合株系用于表型；抗病评价采用田间自然发病与室内塑料营养钵定量接种（1×10⁷ CFU/mL孢子悬液）双体系，配合茎剖病指、ITS-qPCR估真菌量、PDA回接回收；机制层用RNA-seq（0 hpi、48 hpi、30 dpi根样）做DEG/KEGG/GO富集，并以qRT-PCR验证JA（RVE2、GhLOX1、MYC2、PDF1.2）与木质素（GhPAL-2、GhPAL-3）通路基因。

研究结果部分，3.1节生物信息学显示GhFEI1编码1083 aa稳定分泌型跨膜LRR-RLK（相对分子质量119391.67，pI 8.64），胞外LRR为识别病原相关分子模式核心模块。3.2节四物种230个FEI分三亚群，陆地棉69个不均分布于26染色体（D亚基因组拷贝更多），启动子富光响应与MeJA/ABA元件，TM-1根组织特异表达。3.3–3.4节克隆3249 bp CDS入pK2GW7.0，农杆菌EHA105转化，T₃纯合无分离。3.5节田间T₃株系蕾期叶病指JM14为52.08（感病S），OE1 10.00、OE2 6.25（高抗HR）、OE3 12.08（抗病R）；吐絮后期茎剖病指JM14 55.83，OE2仅6.67（HR），qRT-PCR证根、茎、叶均过表达且OE2根/茎更高。3.6节株高、果枝数、单株铃数、衣分及纤维长度/强度/整齐度/马克隆值/伸长率与野生型无显著差异。3.7节根扫描示OE系总根长、投影面积、表面积、体积及分枝数显著增加。3.8节室内接种OE2在10 dpi病指6.67（R）而JM14为25（S），28 dpi茎维管褐变轻，ITS-qPCR真菌量低，PDA回接菌丝极少，GhFEI1在48 hpi根/茎诱导达峰。3.9节RNA-seq得2581 DEG（48 hpi富集571上/737下，30 dpi 307上/131下）。3.10节KEGG示植物激素信号转导、MAPK、植物-病原互作富集，GO落于JA信号、防御响应、木质素生物合成、细胞壁、过氧化物酶活。3.11节qRT-PCR证接种后48–72 hpi OE2根/茎中RVE2、GhLOX1、MYC2、PDF1.2及GhPAL-2、GhPAL-3显著上调。3.12节归纳GhFEI1通过优化根构型+细胞壁木质化物理屏障+JA系统免疫多层抑制V. dahliae侵染。

讨论部分指出，FEI家族此前仅在拟南芥参与细胞壁与根发育，本研究首次在棉花证明LRR-RLK类GhFEI1以“结构防御（促根+木质化）”与“激素免疫（JA级联）”协同抗土传黄萎病，区别于单通路抗病基因；转基因系不损农艺与品质，可作多抗聚合核心亲本。结论部分翻译如下：本研究在陆地棉基因组鉴定69个FEI成员均含LRR域，启动子富SA/MeJA/防御元件；农杆菌转化获3个GhFEI1过表达系，温室与室内证其抑制维管褐变及V. dahliae体内定殖从而增强抗黄萎病，同时增总根长/表面积/分枝数而不改农艺纤维产量；转录组示抗性依赖激素转导、MAPK级联及植物-病原互作，qRT-PCR验JA（RVE2、GhLOX1、MYC2、PDF1.2）与木质素（GhPAL-2、GhPAL-3）基因上调。综上GhFEI1通过促根构型优化与细胞壁木质化物理屏障、持续激活JA介导系统防御双模正向调抗，是棉花黄萎病抗性关键基因，为分子育种提供资源与理论基础。