对TALE基因家族的全基因组分析表明，AcTALE13是猕猴桃（Actinidia chinensis）成熟过程中的关键调控因子

《Postharvest Biology and Technology》：Genome-wide characterization of the TALE gene family identifies AcTALE13 as a key ripening regulator in kiwifruit ( Actinidia chinensis)

　　•全基因组分析在猕猴桃中发现了39个TALE超家族基因。•AcTALE13是一种新的促进果实采后成熟的正向调节因子。•瞬时实验表明AcTALE13能加速猕猴桃的软化过程。•AcTALE13可直接激活AcACS2启动子，从而促进乙烯合成。1. 引言猕猴桃（Actinidia chinensis）因其丰富的营养价值和美味的口感而备受全球重视（Drummond, 2013；Wang等人，2022b）。它被誉为“水果之王”，是维生素C、类胡萝卜素、矿物质、纤维以及其他重要营养素的优质来源。在日常饮食中加入猕猴桃不仅能促进消化，还对人体有多种益处（Stonehouse等人，2013）。采后成熟阶段对猕猴桃而言至关重要，在此期间，果实会逐渐变软，酸味减少，甜度增加，从而提升其可食性。因此，研究猕猴桃采后成熟的调控机制对于提高果实的采后品质和保质期具有重要意义。作为典型的呼吸跃变型水果，猕猴桃的成熟过程受多种植物激素调控，其中乙烯起着不可替代的作用。乙烯的生物合成受到两种关键酶——1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶（ACS）和ACC氧化酶（ACO）的严格调控。这些编码酶的基因通过转录、转录后及翻译后调控机制来应对复杂多变的环境条件（Khan等人，2024）。在这些调控机制中，由转录因子（TFs）介导的转录调控尤为重要，这在多种模式植物中的大量研究已得到证实（Booker和DeLong，2015）。例如，SlERF.F12通过直接结合到ACS2和ACS4的启动子上来抑制它们的表达（Deng等人，2022b）。同样，SlGRAS4通过直接结合并激活SlACO1和SlACO3的启动子来加速番茄果实的成熟（Liu等人，2021）。在番茄中，通过RNAi沉默TAGL1可显著降低乙烯的产生，主要是通过下调ACS2实现的（Vrebalov等人，2009），而RIN则直接结合并激活ACS4启动子，从而在番茄果实成熟过程中调控乙烯合成（Ito等人，2017）。在猕猴桃中，AcWRKY40通过结合AcSAM2、AcACS1和AcACS2的启动子来调控乙烯的产生（Gan等人，2021）。此外，AdNAC2/3可促进‘Hayward’猕猴桃中AdACS1的表达，进而调控乙烯合成（Wu等人，2020）。尽管已知有许多转录因子家族可通过调控乙烯生物合成基因来影响果实成熟，但诸如TALE家族这类转录因子家族在猕猴桃中的作用及其分子机制仍大多未被探索。在植物中，同源框基因家族包含14个亚类，它们根据特定的同源框结构域（HD）序列和特征性的共结构域而被区分开来（Mukherjee等人，2009）。其中，KNOX（KNOTTED1样同源框）和BELL（BEL1样同源框）亚类构成了TALE超家族，其特点是同源框结构域中多出三个氨基酸，形成了一个与同源框结构域相连的额外环结构。TALE家族成员在模式植物中已被广泛研究（Liao等人，2024）。在番茄中，TALE家族成员TKN2/4已被证明会影响果实中的叶绿体发育（Nadakuduti等人，2014）。此外，BEL1-LIKE HOMEODOMAIN11（SlBEL11）通过调节生长素水平来控制果实脱落区中的类黄酮含量，从而防止果实过早脱落（Dong等人，2024）。另外，KNOX和BELL蛋白通常通过形成异二聚体来发挥转录因子的功能（Hamant和Pautot，2010）。最近，在番茄中发现了75对KNOX-BELL相互作用（Ezura等人，2022）。在拟南芥中，BELL家族成员PENNYWISE（PNY）与KNOX家族成员BREVIPEDICELLUS（BP）协同作用，共同调控花序节间结构（Smith和Hake，2003）。BEL1-LIKE HOMEODOMAIN 6（BLH6）与类似KNOTTED结构的同源框蛋白KNOTTED Arabidopsis thaliana7（KNAT7）相互作用，通过降低REVOLUTA/INTERFASCICULAR FIBERLESS1（REV/IFL1）的表达来调控次生细胞壁的形成（Liu等人，2014）。迄今为止，针对猕猴桃中TALE基因家族的全面分析还十分缺乏。此外，TALE家族成员在猕猴桃果实成熟调控中的作用及其作用机制也几乎还未被了解。在本研究中，我们对猕猴桃中的TALE基因家族进行了全基因组范围的鉴定和系统分析。通过分析猕猴桃在不同发育阶段的所有AcTALE基因的表达谱，我们发现了四个基因（AcTALE34、AcTALE37、AcTALE13和AcTALE16）表现出与采后成熟相关的表达模式。通过表达相关性分析、瞬时过表达试验和双荧光素酶试验、瞬时过表达和基因沉默试验、酵母单杂交、EMSA以及双荧光素酶试验，我们发现AcTALE13通过直接调控猕猴桃中关键的乙烯生物合成基因AcACS2的表达，从而发挥重要的成熟调控作用。我们的研究结果为TALE家族基因在果实成熟调控中的作用提供了新的见解。2. 材料与方法2.1 猕猴桃中TALE基因的全基因组鉴定为了在猕猴桃基因组中识别TALE超家族基因，我们采用了隐马尔可夫模型（HMM）搜索（http://hmmer.janelia.org/）以及利用从TAIR获取的拟南芥TALE蛋白序列进行的BLASTP搜索（https://www.arabidopsis.org/）。从猕猴桃基因组数据库（http://kiwifruitgenome.org/）中检索到了可能的猕猴桃TALE蛋白序列。为确保准确性，这些序列还通过NCBI-CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）进行了筛选，以去除重复的候选序列以及那些缺乏典型TALE结构域的序列。利用ExPASy上的ProtParam工具（https://web.expasy.org/protparam/），预测了每个猕猴桃TALE蛋白的基本物理化学性质，包括分子量（MW）和等电点（pI）。此外，还使用Cell-PLoc 2.0软件（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc?2/）来预测这些蛋白的亚细胞定位。2.2 系统发生树分析我们使用MEGA-X软件（Kumar等人，2018）以及NJ算法构建了系统发生树，并进行了1000次自助法重复分析。之后，使用EvolView软件（https://www.evolgenius.info/evolview/）对这棵树进行了注释和可视化处理（Subramanian等人，2019）。2.3 基因结构分析及保守基序挖掘猕猴桃的基因组序列和编码序列来自猕猴桃基因组数据库，我们使用Gene Structure Display Server网站（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析了这些序列的外显子-内含子结构。通过MEME工具（https://meme-suite.org/meme/tools/meme）来检测保守基序模式，将检测到的基序数量上限设置为20个，其他参数则采用默认值。同时，还利用Pfam数据库分析了猕猴桃TALE蛋白的保守结构域，结果则通过TBtools工具进行可视化展示（Chen等人，2023）。2.4 猕猴桃TALE基因启动子顺式元件分析为了探究潜在的启动子顺式元件，我们从猕猴桃基因组中获取了每个TALE基因转录起始位点上游2000 bp的序列，然后使用PlantCARE数据库（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）对这些序列进行了分析。2.5 染色体定位及基因重复分析根据从猕猴桃基因组数据库下载的基因组注释文件，我们确定了猕猴桃基因组中TALE基因的染色体位置。通过One Step MCScanX工具检测了AcTALE基因之间的种内共线性，随后再用TBtools工具对结果进行可视化展示。2.6 猕猴桃TALE基因的表达谱我们从NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载了转录组数据集（PRJNA277383、PRJNA328414和PRJNA436459），以便进一步分析。这些数据集包含了经过乙烯处理过的果实、被病原菌感染的果实，以及在使用乙霉威处理或未进行任何处理的果实样本。在转录组重新分析过程中，以‘Ac’猕猴桃基因组作为参考（Pilkington等人，2018）。使用HISAT2（v2.0.1）工具对清洁后的读取序列进行比对（Kim等人，2019），然后使用STRINGTIE（v2.1.5）工具对序列进行组装和定量分析（Pertea等人，2015）。mRNA的表达水平是通过每百万转录本数（TPM）来进行标准化的。之后使用TBtools工具对数据进行处理，并将TPM值范围标准化到0–1之间。最后，根据基因的表达模式对它们进行聚类分析。2.7 加权基因共表达网络分析我们使用R软件（v4.2.1）以及WGCNA相关包（Langfelder和Horvath，2008）进行了加权基因共表达网络分析。通过斯皮尔曼相关系数生成基因间的相关矩阵。我们选择β =?9作为参数，通过幂次邻接函数将相关矩阵转换为邻接矩阵。接着，从邻接矩阵中构建出拓扑重叠矩阵（TOM）。最小模块大小被设定为50（minModuleSize = 50）。在WGCNA软件中利用blockwiseModules函数来识别不同的模块，然后根据模块特征基因（MEs）将彼此密切相关的模块合并在一起。2.8 植物材料猕猴桃（Actinidia chinensis）样本是从中国四川省什邡市的一个农场采集的。我们将果实外果皮的少量组织去掉果皮和种子后，立即放入液氮中冷冻，然后在-80℃条件下保存，以备后续分析使用。总可溶性固体含量是使用数字折射仪（Atago，日本东京）测定的，具体方法是把捣碎的果实上清液滴在折射仪上。果实的硬度则是按照先有研究方案（Deng等人，2018）使用TA.XT plus质地分析仪（Stable Microsystems，英国戈达林厄姆）进行测量的。2.9 乙烯产生量的测定乙烯产生的测定方法与先前描述的方法类似（Deng等人，2022a），但有一些细微调整。简而言之，我们将在不同采收天数后收获的猕猴桃放入敞口烧瓶中放置2小时，以消除机械损伤带来的影响。之后将烧瓶密封，在室温下培养2小时，然后取出1毫升的瓶内气体，注入装有火焰离子化检测器（FID）的Agilent 7890B气相色谱仪中进行分析。用于测定呼吸速率的色谱条件如下：使用CTR1色谱柱，柱温为80°C，进样口温度为140°C，以氦气作为载气，流速为30毫升/分钟，同时使用热导检测器，检测温度为150°C。而用于测定乙烯含量的色谱条件则为：使用填充有活性氧化铝的色谱柱，柱温为80°C，进样口温度为140°C，载气仍为氦气，流速为30毫升/分钟，FID的检测温度为150°C。通过将与已知浓度的乙烯标准品进行比较，来量化猕猴桃产生的乙烯量，并将其按果实鲜重进行标准化处理。2.10 花青素含量的测定花青素含量的测定方法是参照Wang等人的研究方法（Wang等人，2022）进行的。我们将冷冻后的果实（20毫克）放入1毫升浓度为1%（体积比）的盐酸甲醇溶液中，在4摄氏度下提取1天。之后将混合液以13,000转/分钟的速度离心15分钟，然后测量上清液在530纳米和657纳米波长处的吸光度。相对花青素浓度是通过公式[A??? ? (1/4?× A??７)]来计算的。2.11 ACS、ACO及淀粉含量的测定ACS和ACO的浓度是按照制造商提供的说明，使用Plant ACS和ACO ELISA试剂盒（sinobestbio，编号YX-010319P、YX-010315P）来测定的。我们在冰浴中，将冷冻样品与预冷却至pH 7.4的PBS缓冲液以1:9的重量比混合后进行研磨。将所得匀浆在4摄氏度下以12,000转/分钟的速度离心10分钟，然后收集上清液。使用微板读数仪测量上清液在450纳米波长处的吸光度，再根据标准曲线计算出上清液中ACS和ACO的浓度。淀粉含量的测定则是按照制造商提供的说明，使用Starch Content Assay Kit（Solarbio，编号BC0705）来进行的。每组实验都重复进行了三次。2.12 RNA提取及RT-qPCR分析我们按照制造商的指导说明，使用Plant RNA Purification Reagent（Invitrogen）从猕猴桃组织中提取总RNA，同时采取相应措施避免基因组DNA的污染。互补DNA的合成则是按照标准流程进行的（Deng等人，2018）。RT-qPCR分析是在Bio-Rad CFX384实时荧光定量系统中进行的，所使用的试剂为2×SYBR Green qPCR Mix（Q431–02；Vazyme，中国南京），检测过程也遵循制造商的规范。相对转录本水平是通过ΔCt方法来确定的，以AcActin作为内部参考基因（Ying等人，2020）。用于RT-qPCR的引物序列列在补充表S3.2中。2.13 瞬时双荧光素酶报告基因试验我们将完整的AcTALE13编码序列克隆到pGreen II 62-SK载体中，作为效应基因，而AcACS2的启动子序列则被插入到pGreen II 0800-LUC双报告基因载体中。随后，我们通过聚乙二醇介导的转染技术，将这些报告基因载体和效应基因载体引入烟草原生质体中。使用Promega公司生产的双荧光素酶报告基因检测系统（Madison，美国威斯康星州）来测定Renilla荧光素酶和萤火虫荧光素酶的活性（Ying等人，2020）。作为对照，我们使用了空的pGreen II 62-SK载体，实验数据以基于三组独立重复实验的LUC/REN比值来表示。用于载体构建的引物序列也列在补充表S3.2中。2.14 酵母单杂交为了进行酵母单杂交（Y1H）实验，我们先用特定引物扩增AcACS2的启动子序列，然后将其克隆到pHIS2载体中。而AcTALE13的编码序列则被克隆到pGADT7载体中，从而构建出AD-TALE13融合基因载体。所有重组质粒都是通过醋酸锂转化法导入Y187酵母菌株中的。首先，将转化后的细胞在缺乏色氨酸、亮氨酸和组氨酸的合成缺失培养基（SD/?Trp/?Leu/?His）上进行筛选。之后，将筛选得到的菌落转移到添加了适当浓度3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）的SD/?Trp/?Leu/?His培养基中，在28摄氏度下培养3天。2.15电泳迁移率变化分析（EMSA）将AcTALE13的全长CDS序列插入pGEX-4T?1载体中。AcTALE13-GST融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中表达，随后使用谷胱甘肽琼脂糖4B（Beyotime，#P2262）进行纯化。在结合反应中，纯化的融合蛋白与3′-生物素标记的DNA探针共同孵育，而单独的纯化GST则作为阴性对照。在竞争实验中，先让未标记的探针与AcTALE13-GST融合蛋白预孵育10分钟，然后再加入3′-生物素标记的探针，以此生成竞争性结合样本。在电泳迁移率变化分析（EMSA）中，每个样本均在5%（w/v）的天然聚丙烯酰胺凝胶上分离，随后使用Super ECL检测试剂（Beyotime，#P0018S）通过化学发光法进行检测。

2.16. 水果中转录因子基因的瞬时过表达与沉默实验采用中华猕猴桃红阳品种的果实进行转录因子基因的瞬时过表达及病毒诱导的基因沉默（VIGS）实验。在VIGS实验中，使用SGN VIGS工具设计了AcTALE13的基因特异性片段。为减少可能的非目标基因沉默，通过BLAST分析将该片段与所有已知的猕猴桃TALE家族成员序列进行比对。含有过表达构建体、VIGS构建体或相应空载体的农杆菌培养物培养至OD600值为0.5时，再用无针注射器将其注入果实的赤道区域。每个果实设置4个均匀分布的注入点。在采收前的瞬时实验中，于开花后100天将含有过表达构建体、VIGS构建体或相应空载体的农杆菌注入果实，之后每隔10天重复一次注入操作，直至开花后140天采集样本，此时以空载体处理组作为对照。在采收后的瞬时实验中，则使用开花后约100天收获的果实。在注入点周围的果实组织分别在注入后0、3、6和9天进行采集。每个果实的4个注入点的样本合并后，立即置于液氮中冷冻，然后储存在-80°C下，以便后续进行生理和分子分析。每种处理组（EV-VIGS、AcTALE13-VIGS、EV-OE和AcTALE13-OE）包含30个被注入农杆菌的果实。共分析3个生物学重复组，而用相应空载体处理的果实则作为对照。统计分析根据具体情况选择学生t检验或单因素方差分析进行。引物序列见补充表S3.3。

结果

3.1. 猕猴桃中TALE家族基因的鉴定为确定中华猕猴桃中的TALE基因家族，我们首先使用从Pfam数据库（http://pfam.xfam.org/）下载的POX、KNOX1、KNOX2和ELK结构域的特定序列，进行了隐马尔可夫模型（HMM）分析。随后，以拟南芥的TALE蛋白为查询序列，进行了BLASTP搜索。最终在猕猴桃中发现了39个TALE家族成员，根据它们在猕猴桃基因组中的染色体位置，将这些成员命名为AcTALE1至AcTALE39（http://kiwifruitgenome.org/）。据预测，这39个TALE基因编码的蛋白质长度在117到751个氨基酸之间（见补充表S1）。这些蛋白质的等电点在4.70到8.02之间，分子量则在13.23到82.67千道尔顿之间（见补充表S1）。此外，它们的脂肪指数在57.26到92.56之间，而疏水性的总体平均值（GRAVY值）则在-1.024到-0.320之间（见补充表S1），这说明所有的AcTALE蛋白都属于亲水性蛋白。不稳定性指数则在33.78到59.83之间。亚细胞定位分析表明，大多数AcTALE蛋白定位于细胞核内，仅有AcTALE38被预测定位于细胞质中（见补充表S1）。为确定这些基因在染色体上的分布情况，我们对39个AcTALE基因在猕猴桃染色体上的实际位置进行了标注。结果显示，这39个基因分布在22条染色体上（见图1）。染色体1、2、3、5、15、18、23和28上各有一个AcTALE基因。染色体6、8、9、10、11、13、14、16、20、25、26和27上各有两个基因，染色体4上有三个基因，而染色体21上有四个基因（见图1A）。下载：下载高分辨率图像（465KB）下载：下载全尺寸图像图1. 猕猴桃中TALE转录因子家族的全基因组鉴定及系统发育分析。(A) AcTALE基因在猕猴桃染色体上的分布情况。刻度尺表示百万碱基对（Mb）。(B) 拟南芥和猕猴桃中TALE蛋白的系统发育树。

3.2. 猕猴桃中TALE家族基因的系统发育分析为探究猕猴桃中TALE基因家族的进化关系及其分类，我们使用了来自猕猴桃的39个AcTALE蛋白以及来自拟南芥的22个AcTALE蛋白，构建了邻接法系统发育树。这39个AcTALE蛋白被分为BELL亚家族和KNOX亚家族两类（见图1B）。BELL亚家族包含23个成员：AcTALE1、AcTALE2、AcTALE3、AcTALE4、AcTALE5、AcTALE7、AcTALE9、AcTALE10、AcTALE12、AcTALE13、AcTALE15、AcTALE17、AcTALE19、AcTALE21、AcTALE25、AcTALE27、AcTALE28、AcTALE29、AcTALE32、AcTALE33、AcTALE36、AcTALE37和AcTALE39。KNOX亚家族则进一步分为三组：KNOX I组（包含AcTALE6、AcTALE8、AcTALE11、AcTALE14、AcTALE22、AcTALE23、AcTALE30、AcTALE31和AcTALE35），KNOX II组（包含AcTALE16、AcTALE18、AcTALE20、AcTALE24、AcTALE26和AcTALE34），以及KNOX III组（包含AcTALE38）。为阐明基因结构与功能之间的关联，我们基于这39个AcTALE成员的基因组和蛋白质序列，分析了它们的保守结构域、 motifs以及CDS/UTR结构。分析结果表明，除了AcTALE38之外，所有KNOX亚家族成员都含有Homeobox_KN、ELK、KNOX1和KNOX2结构域，而所有BELL亚家族成员则含有POX和Homeobox_KN结构域，这一结果与它们所处的亚家族分类是一致的（见图2）。在39个AcTALE成员中总共发现了20种motifs，每种蛋白质所含的motifs数量在2到13个不等。下载：下载高分辨率图像（524KB）下载：下载全尺寸图像图2. 猕猴桃AcTALE基因的进化关系、motifs、保守结构域及基因结构分析。(A) 系统发育树。(B) Motifs分析。(C) 保守结构域分析。(D) 基因结构分析。

3.3. 猕猴桃中TALE家族基因的顺式作用调控元件分析启动子区域中的顺式作用元件对于调控基因表达至关重要。为识别这些元件，我们利用PlantCARE数据库分析了所有39个AcTALE基因的翻译起始位点上游2000个碱基对的基因组序列。共鉴定出14种类型的顺式作用元件，并将其分为四类：与胁迫相关的元件、与植物生长发育相关的元件、与植物激素相关的元件以及与光响应相关的元件（见图3A）。在所有AcTALE基因的启动子中，与光响应相关的元件出现频率最高，这表明光信号广泛地调控着这一基因家族。值得注意的是，有若干AcTALE基因缺乏与胁迫相关的元件（AcTALE4、AcTALE7、AcTALE8、AcTALE9、AcTALE10、AcTALE13、AcTALE15、AcTALE17、AcTALE22、AcTALE25、AcTALE27、AcTALE30、AcTALE31、AcTALE32、AcTALE33、AcTALE36和AcTALE37）。此外，在四种与激素相关的元件中，与脱落酸响应相关的ABRE motif出现频率最高。顺式作用元件的多样性表明，AcTALE基因会随着多种环境和发育信号的刺激而发生转录重编程。下载：下载高分辨率图像（719KB）下载：下载全尺寸图像图3. 猕猴桃TALE基因的顺式调控元件及同源性分析。(A) AcTALE基因启动子序列分析。(B) AcTALE基因的同源性分析。

3.4. 猕猴桃中TALE家族基因的同源性分析基因复制事件推动了基因家族的扩展以及功能的新变化。为探究AcTALE基因的复制模式，我们使用MCScanX进行了全基因组共线性分析。分析结果显示，有31组AcTALE基因对表现出较高的共线性（见图3B）。我们还计算了这些基因对之间的非同义替换率（Ka）与同义替换率（Ks）之比。所有的Ka/Ks值均严格小于1（见补充表S2），这一结果表明，在AcTALE家族的进化过程中，存在着强烈的自然选择压力。

3.5. AcTALE家族基因的表达模式分析为研究AcTALE基因在猕猴桃发育过程及采后成熟过程中的功能，我们重新分析了之前研究中的转录组数据（Wang等人，2022年）。通过对不同发育阶段的AcTALE基因进行检测，我们发现某些特定的基因，尤其是AcTALE34、AcTALE37、AcTALE13和AcTALE16，在采后成熟阶段表现出上调趋势（见图4）。此外，通过对经过外源乙烯处理后的果实转录组进行分析，我们发现有些AcTALE基因的表达显著上升，而有些则受到抑制，这表明它们在果实成熟过程中的乙烯信号传导网络中发挥着动态的作用。下载：下载高分辨率图像（889KB）下载：下载全尺寸图像图4. 基于转录组数据的AcTALE基因表达谱。(A) 不同发育阶段果实中AcTALE基因的表达谱（DAP表示授粉后天数；DAH表示采收后天数）。(B) 不同发育阶段果实以及经乙烯处理过的果实中AcTALE基因的表达谱（DAFB表示果实完全开花后的天数；DAT表示接受乙烯处理后的天数）。(C) 对抗病原菌Psa感染及施用ASM（阿西苯唑-S-甲酯）处理后AcTALE基因的表达谱。健康对照组为未接种Psa病原菌也未接受ASM处理的样本。Psa3、Psa24和Psa48分别表示接种Psa病原菌后3小时、24小时和48小时的样本。(D) Psa病原菌侵入过程中AcTALE基因的表达谱。Ac_0DPI、Ac_2DPI、Ac_14DPI分别表示猕猴桃接种Psa病原菌后的对应天数。我们还研究了AcTALE基因在猕猴桃感染假单胞菌野油菜致病变种时的表达变化情况。如图4C所示，多个AcTALE基因（AcTALE5、7、9、13、24、25和37）的转录水平呈现出一致的规律：在感染初期表达水平较低，随后随着感染的进展逐渐上升。有趣的是，与未经处理的样本相比，施用ASM处理后，这些AcTALE基因的表达水平有所下降。图4D进一步展示了在Psa病原菌侵袭作用下AcTALE基因的表达动态变化情况。某些AcTALE基因的表达上升，表明它们可能参与了植物对Psa病原菌感染的响应机制。

3.6. TALE家族基因的共表达基因网络分析为阐明AcTALE基因在果实成熟过程中的作用，我们进行了加权基因共表达网络分析（WGCNA）。经过筛选后，共有25,880个基因被分为8个模块（见图S1A）。值得注意的是，AcTALE13、AcTALE16、AcTALE34和AcTALE37在采后成熟阶段表现出较高的表达特异性。AcTALE13、AcTALE16和AcTALE37被归入MEblue模块，而AcTALE34则被归入MEblack模块，这表明它们在果实成熟过程中具有重要的协同作用。通过对这些基因与其他基因之间的相关性分析，我们发现AcTALE13与AcACS2、AcAMY1和AcBAM9这三种对果实成熟至关重要的基因存在较强的相关性。先前的研究已经发现，KNOX蛋白和BLH蛋白会形成异二聚体来调控目标基因。为进一步探索KNOX蛋白与BLH蛋白之间可能形成的转录调控模块组合，我们构建了AcTALE基因的共表达网络（见图S1B）。包括AcTALE2、AcTALE7、AcTALE15、AcTALE19、AcTALE21、AcTALE25、AcTALE27、AcTALE32和AcTALE33在内的9个BLH基因表现出高度的正向共表达现象。在这些基因中，有21对基因的相关系数大于0.95，其余基因对的相关系数则大于0.85。同一亚家族内的基因或不同亚家族间的基因之间存在正向相关性，这表明它们可能存在功能冗余或相互作用关系。

3.7. AcTALE13可促进猕猴桃采后果实成熟为探究AcTALE13在猕猴桃采后果实成熟过程中的生物学功能，我们使用了已经成熟的商品化猕猴桃（大约处于开花后100天）进行了瞬时过表达（OE）和病毒诱导的基因沉默（VIGS）实验。在注入农杆菌后0、3、6和9天，分别采集果实组织用于生理指标分析（见图5A）。RT-qPCR分析结果显示，在整个实验期间，AcTALE13确实实现了成功的过表达和沉默（见图5B）。下载：下载高分辨率图像（515KB）下载：下载全尺寸图像图5. AcTALE13可促进猕猴桃采后果实成熟。(A) 在采后储存期间，对中华猕猴桃红阳品种的果实进行AcTALE13的瞬时过表达（OE）或病毒诱导的基因沉默（VIGS）处理后，其表现出的典型表型。这些果实分别在注入农杆菌后0、3、6和9天进行了拍照。底部图片显示的是注入农杆菌后9天时从果肉中提取的典型花青素样本。(B) 通过RT-qPCR技术，在注入农杆菌后0、3、6和9天，检测了经历瞬时过表达处理和VIGS处理的果实中AcTALE13的相对表达水平。数据为三个生物学重复组的平均值±标准差。在不同采样时间点，若不同处理组之间的差异具有显著性，则用不同的小写字母表示（P<0.05，采用单因素方差分析后再进行Tukey多重比较检验）。(C) AcTALE13-VIGS处理后的果实在进行采后成熟过程中所出现的生理变化，包括乙烯的产生量、ACC合成酶（ACS）的含量、ACC氧化酶（ACO）的含量、果实硬度、花青素含量、淀粉含量以及总可溶性固体含量（TSS）。(D) AcTALE13-OE处理后的果实在进行采后成熟过程中所出现的生理变化，包括乙烯的产生量、ACS含量、ACO含量、果实硬度、花青素含量、淀粉含量以及TSS含量。数据同样为三个生物学重复组的平均值±标准差。星号表示在相同时间点下，处理组与相应空载体对照组之间存在显著差异（*P?
3.8 AcTALE13调控与成熟相关的基因表达为进一步阐明AcTALE13介导的果实成熟背后的分子机制，研究人员通过RT-qPCR分析了与乙烯生物合成、乙烯信号传导、细胞壁代谢、花青素生物合成、淀粉-糖代谢以及成熟相关转录因子相关的代表性基因的表达情况。与乙烯产量变化的生理现象一致，乙烯生物合成基因AcACS2和AcACO1的表达水平在AcTALE13过表达后被显著上调，而在VIGS介导的沉默处理中被抑制（图6A）。乙烯信号传导基因AcEIL2和AcERF061也表现出相似的表达模式（图6B），这说明AcTALE13通过协调调控乙烯生物合成和信号传导途径来促进采后成熟。下载：下载高分辨率图像（520KB）下载：下载全尺寸图像图6. AcTALE13在猕猴桃采后成熟过程中调控与成熟相关的基因表达。通过RT-qPCR检测了AcTALE13过表达组和沉默组在0、3、6、9天发育期时代表性成熟相关基因的相对转录水平。(A) 乙烯生物合成相关基因（AcACS2和AcACO1）。(B) 乙烯信号传导相关基因（AcEIL2和AcERF061）。(C) 细胞壁代谢相关基因（AcPL和AcPG）。(D) 花青素生物合成相关基因（AcF3GT和AcANS）(E) 淀粉降解相关基因（AcAMY1和AcBAM9）。(F) 与成熟相关的转录因子（AcNAC6和AcMADS1）。不同小写字母表示在每个采样时间点各处理组之间存在显著差异（n=3，P?
3.9 AcTALE13直接结合并转录激活AcACS2启动子表达分析显示，猕猴桃中AcTALE13的转录水平与AcACS2的转录水平之间存在显著的正相关关系，这表明AcACS2可能是AcTALE13通过该途径促进果实成熟的下游靶标。为确定AcTALE13是否与AcACS2启动子结合，研究人员首先进行了酵母单杂交实验。与AcTALE13及AcACS2启动子构建体共转化的酵母细胞能在选择培养基上正常生长，而阴性对照组则无生长现象，这证明AcTALE13能够在体内与AcACS2启动子结合（图7A）。为进一步在体外验证这种直接相互作用，研究人员使用了纯化的重组GST-AcTALE13蛋白进行了凝胶迁移实验（EMSA）（图7B和7C）。在AcACS2启动子中发现了两个可能的TALE结合位点（P1和P2，即TGAC序列），并选取它们进行EMSA分析。AcTALE13与这两个探针都形成了DNA-蛋白质复合物，导致明显的凝胶迁移变化（图7C）。此外，过量的未标记探针能够有效竞争掉这些迁移后的条带，而预测的结合位点发生突变则会导致这种相互作用消失，从而证明了AcTALE13能够特异性地结合AcACS2启动子中的这两个顺式元件（图7C）。为确定启动子结合是否会导致转录激活，研究人员进行了双荧光素酶报告基因实验。与空载体对照组相比，共表达AcTALE13显著提升了AcACS2启动子的活性（图7D和7E）。综合这些结果表明，AcTALE13能够直接结合并转录激活AcACS2启动子。下载：下载高分辨率图像（381KB）下载：下载全尺寸图像图7. AcTALE13直接结合并转录激活AcACS2启动子。(A) 酵母单杂交实验表明AcTALE13与AcACS2启动子结合。(B) 用于EMSA实验的纯化重组GST-AcTALE13融合蛋白的SDS-PAGE分析结果。(C) EMSA实验结果显示AcTALE13蛋白与AcACS2启动子片段直接结合。(D) 报告基因载体和效应基因载体的结构示意图。(E) 在双荧光素酶报告基因实验中，AcTALE13增强了AcACS2的转录。数值为三次生物学重复实验的平均值，误差条代表标准差。*P?
4. 讨论TALE超家族基因在植物基因组中广泛存在，已被证实与发育调控和胁迫适应有关（Hamant和Pautot，2010；Wang等人，2022a；Zhao等人，2019；Zhao等人，2022）。尽管在番茄、拟南芥和马铃薯等模式植物和作物物种中已有全基因组范围的TALE基因研究报道（Ezura等人，2022；Hamant和Pautot，2010；Sharma等人，2014），但在猕猴桃中的系统研究仍然较少。在本研究中，研究人员在猕猴桃中鉴定出了39个AcTALE基因，并从染色体分布、系统发育关系、保守结构域、 motif结构、外显子-内含子组织、复制模式、顺式调控元件以及果实发育过程中的表达动态等方面对其进行了全面分析。系统发育分析将这39个AcTALE基因分为四个亚家族，这与拟南芥中已建立的TALE分类体系基本一致。每个AcTALE亚家族都具有独特的结构域或motif组合（图3），同一支系内的基因具有相似的结构，这表明它们具有共同的进化起源和潜在的功能保守性。特定的结构域和motif对于蛋白质-蛋白质相互作用和DNA结合至关重要。例如，在拟南芥中，属于BELL亚家族的蛋白质含有POX结构域，这类蛋白质能与KNAT2和KNAT5发生相互作用（Hamant和Pautot，2010；Magnani和Hake，2008）。ELK结构域包含保守的谷氨酸、亮氨酸和赖氨酸残基，它既可作为核定位信号，也有助于与其他蛋白质形成复合物（Ito等人，2002；Kerstetter等人，1994；Nagasaki等人，2001；Sakamoto等人，1999）。此外，KNOX1和KNOX2共同构成MEINOX区域，这一区域对于二聚化以及后续的转录调控非常重要（Nagasaki等人，2001）。特定AcTALE亚家族内部的高度结构保守性表明，这些基因在进化过程中保留了关键的祖先功能。不同亚家族之间的结构差异也可能反映出功能的特化。值得注意的是，在猕猴桃中，KNOX支系的扩展程度似乎不如BELL支系。AcTALE基因之间的内含子数量和基因结构差异很大，这可能反映了不同谱系的特异性分化和新功能形成，因为内含子动态通常与基因家族的进化密切相关（Roy和Gilbert，2006；Roy和Penny，2007）。启动子分析显示，与光响应、发育、激素信号传导以及胁迫相关的顺式元件在AcTALE基因启动子区域较为丰富，这一结果支持了AcTALE基因参与多因素调控程序而非单一线性途径的假设。顺式元件分析进一步佐证了这一观点，该分析发现AcTALE基因启动子区域富含对光、发育调控、植物激素以及环境胁迫有响应的motif。例如，AcTALE23含有大量的ABRE元件，这表明它可能对植物激素ABA有响应（图3A）。发育阶段表达分析也显示，尽管不同基因家族成员之间存在较大差异，但某些BELL亚家族和KNOX II亚家族的基因在发育后期会上调，因此这些基因有望成为参与成熟调控的候选基因。已知TALE蛋白主要以异二聚体形式发挥作用，其中BELL亚家族的成员通过保守的相互作用结构域与KNOX亚家族的成员相互作用，从而协同调控目标基因的转录（Hay和Tsiantis，2010）。由于AcTALE13属于BELL亚家族且含有相关的相互作用motif，因此它很可能招募来自AcKNOX类的伴侣蛋白，形成功能性转录复合物，共同调控下游的目标基因，如AcACS2。这一假设得到了在AcTALE13中发现的保守的BELL特异性相互作用结构域，以及在多种植物物种中普遍存在的KNOX–BELL异二聚化现象的支持。不过，目前仍需要直接的相互作用证据，可通过酵母双杂交、BiFC和共免疫沉淀等实验来获得。果实成熟是由复杂的激素网络调控的（Fenn和Giovannoni，2020）。虽然我们的数据明确表明AcTALE13受乙烯诱导，但其启动子结构提示它可能还对其他激素产生响应，包括ABA和生长素。在多肉果实中，ABA通常与成熟启动有关，而生长素则一般会延缓成熟的进程（Liao等人，2018；Ouyang等人，2025）。因此，AcTALE13可能作为一个转录节点，整合多种激素信号（Niu等人，2026）。这一假设需要通过控制性的多激素处理实验来进一步验证。从进化的角度来看，猕猴桃与番茄等模式系统之间存在物种特有的差异。在番茄中，TALE基因家族的成员（如TKN2和TKN3）主要与分生组织维持、叶片形态形成以及早期果实发育结构有关（Avivi等人，2000；Sun等人，2025）。在番茄中，某些TALE基因的过表达往往会影响果实的形态，而非直接引发需熟果实的自催化乙烯爆发式释放（Shtern等人，2023；Sun等人，2025）。相比之下，我们的研究结果表明，AcTALE13可能通过结合AcACS2启动子并促进其转录激活，在猕猴桃成熟过程中发挥了更为直接的作用。鉴于猕猴桃对乙烯的高度敏感性以及其特有的采后变化特征（如淀粉快速降解和果肉软化），这种调控机制可能是猕猴桃为适应自身演化而形成的成熟调控方式。总体而言，这些研究结果表明，保守的TALE转录因子框架可以在不同物种间发生重新配置，从而支持不同的果实发育和成熟过程。

5. 结论总之，本研究对猕猴桃中的TALE基因家族进行了全面的全基因组分析。我们鉴定了39个AcTALE基因，并系统地阐述了它们的系统发育关系、保守的结构特征以及多样的顺式调控元件，为这一基因家族建立了基础的基因组框架。研究表明，AcTALE13是果实成熟的正向调控因子。从机制上来看，AcTALE13直接作用于AcACS2的启动子并使其转录激活，进而推动乙烯生物合成，加速果实软化，并促进可溶性固形物的积累。这些发现不仅深化了我们对TALE超家族在植物发育中作用的理解，还为通过生物技术手段改良猕猴桃的贮藏期和采后品质提供了有价值的遗传靶标。CRediT作者贡献说明毛天浩：撰写——初稿、可视化、验证、研究、数据整理。杨成鹏：撰写——审阅与编辑、项目管理、方法学。刘明春：撰写——审阅与编辑、指导、方法学、资金获取。尹彦鹏：撰写——初稿、可视化、验证、研究、数据整理。郑森林：撰写——审阅与编辑、指导、方法学。李明章：资源提供、项目管理、概念设计。陈迪：撰写——审阅与编辑、方法学。庄启国：指导、资源提供、项目管理、资金获取。杜奎：研究、数据整理、概念设计。周远毅：研究、概念设计。谢悦：资源提供、项目管理。王涵：研究、概念设计。尹彦鹏|郑森林|毛天浩|杨成鹏|王涵|周远毅|谢悦|庄启国|杜奎|李明章|陈迪|刘明春