伪装蛋白工程化细胞外囊泡通过劫持Caspase-1抑制细胞焦亡缓解TMJ-OA

《Journal of Extracellular Vesicles》：Camouflage Protein-Engineered Extracellular Vesicles Alleviate TMJ-OA by Hijacking Caspase-1 to Suppress Pyroptosis

　　

颞下颌关节骨关节炎（TMJ-OA）发病率高且起病隐匿。该疾病常伴有严重炎症和显著退行性改变，而目前的临床治疗仍不充分。在本研究中，研究人员聚焦于细胞焦亡（pyroptosis），设计了一种伪装蛋白（GSDMD-C），并将其附着于小细胞外囊泡（small extracellular vesicles, sEVs）的膜表面，形成sEV-p。sEV-p具有两个关键作用：首先，sEVs固有的免疫调节和营养支持特性促进病理条件下细胞功能的恢复；其次，伪装蛋白与活化的Caspase-1结合，减少内源性GSDMD的切割。通过体外实验以及对小鼠和巴马小型猪TMJ-OA模型的治疗，评估了sEV-p的治疗效果。研究人员进一步通过单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing）阐明了其机制。结果表明，sEV-p可减轻由细胞焦亡诱导的炎症因子异常激活，同时伴随炎症细胞比例降低和急性炎症反应缓解。

**论文解读：伪装蛋白工程化细胞外囊泡通过劫持Caspase-1抑制细胞焦亡缓解TMJ-OA**

**研究背景与问题**
颞下颌关节骨关节炎（TMJ-OA）是一种高发性、起病隐匿的退行性关节疾病，常伴有严重炎症和软骨破坏。其病理机制涉及多种细胞死亡方式，其中细胞焦亡（pyroptosis）通过Caspase-1激活切割GSDMD蛋白，释放N端片段（GSDMD-N）形成膜孔，导致炎症因子（IL-1β、IL-18）释放，引发级联性炎症和组织损伤。现有治疗手段效果有限，针对细胞焦亡的靶向策略尚不成熟。因此，研究人员旨在开发一种基于工程化小细胞外囊泡（sEVs）的“诱饵”策略，通过竞争性结合活化的Caspase-1抑制细胞焦亡，从而缓解TMJ-OA。

**主要技术方法**
1. **sEVs分离与工程化修饰**：通过超速离心从三维（3D）培养的人骨髓间充质干细胞（BMSCs）上清中分离sEVs；利用DSPE-PEG-MAL作为连接分子，将纯化的His-GSDMD-C融合蛋白（伪装蛋白）共价偶联至sEVs膜表面，获得sEV-p。
2. **体外细胞焦亡模型**：采用LPS和ATP联合刺激THP-1细胞（经PMA诱导分化为M1型巨噬细胞）建立细胞焦亡模型，优化ATP刺激时间（6小时）。
3. **动物模型**：小鼠TMJ-OA模型通过关节腔注射碘乙酸钠（MIA）诱导；巴马小型猪TMJ-OA模型通过注射木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸诱导。
4. **单细胞转录组分析**：治疗5天后收集小鼠TMJ髁突及周围组织，制备单细胞悬液，利用10X GENOMICS平台构建文库并进行Illumina测序，经Seurat、DoubletFinder、harmony等软件处理和分析。

**研究结果**

**4.1 sEVs的分离、提取与鉴定**
通过3D生物反应器大规模扩增MSCs，sEVs粒径约122.5 nm，sEV-p粒径增至135.3 nm，均呈典型杯状形态。流式细胞术确认表面标志物CD9、CD63表达，修饰后阳性率略有下降。

**4.2 体外细胞焦亡模型的建立**
优化ATP刺激时间为6小时，此时细胞焦亡相关基因表达显著上调。通过浓度梯度实验确定GSDMD-C的最佳工作浓度：4 μg蛋白修饰于5 μg sEVs上构建sEV-p。

**4.3 sEV-p对细胞焦亡的影响**
与对照组相比，sEV-p预处理组细胞焦亡特征（伪足回缩、肿胀）减轻；ELISA显示IL-18和IL-1β分泌显著降低（10小时内累积释放减少30%）；qRT-PCR检测到所有焦亡相关基因表达下调；Western blot证实sEV-p可减少GSDMD-N片段生成，表明其有效抑制Caspase-1对GSDMD的切割。

**4.4 sEV-p对BMSCs增殖和迁移的影响**
CCK-8和Ki67染色显示sEV-p促进BMSCs增殖（48和72小时显著）；Transwell和划痕实验表明sEV-p显著增强BMSCs的垂直和水平迁移能力，且迁移相关基因（mif、agt等）表达上调。

**4.5 sEV-p对巨噬细胞极化和氧化应激的影响**
免疫荧光显示sEV-p降低M1型巨噬细胞标志物CD86表达；ROS检测表明sEV-p显著减轻H₂O₂诱导的氧化应激。

**4.6 sEV-p在小鼠TMJ-OA中的治疗效果**
H&E和番红O-固绿染色显示，sEV-p组在7、14、21天时软骨层结构更完整，Ⅱ型胶原纤维降解较轻，软骨细胞排列更规则，ECM降解减少。免疫荧光显示sEV-p组Ⅱ型胶原表达最高，TUNEL阳性细胞最少，MMP13和IL-1β表达最低，表明sEV-p延缓OA进展并保护软骨细胞。

**4.7 TMJ-OA小鼠单细胞转录组景观**
单细胞测序识别出17种主要细胞类型。sEV-p组软骨细胞比例最高（11.1%），成纤维细胞比例最低（12%），提示抑制纤维化。细胞焦亡评分显示sEV-p组主要关节细胞焦亡相关性最低。差异基因分析显示sEV-p下调Spp1（与OA软骨退化相关），上调Igfbp5和Col6a5（稳定ECM）。功能富集分析表明sEV-p调控软骨细胞和滑膜细胞的ECM组织相关通路，促进修复而抑制纤维化。

**4.8 sEV-p在巴马小型猪TMJ-OA中的治疗效果**
组织学染色显示，sEV-p组在1个月和3个月时关节表面更规则，软骨层更厚，番红O染色增强（蛋白聚糖含量增加），软骨细胞簇减少，IL-18免疫组化染色阳性细胞最少。OARSI评分证实sEV-p组在软骨细胞密度和簇集评分上优于sEV组。

**总结与讨论**
sEV-p通过“分子竞争”和“分子诱饵”机制，竞争性结合活化的Caspase-1，减少内源性GSDMD切割，从而抑制细胞焦亡。这一初始阻断切断了炎症扩增的源头，改善氧化应激和巨噬细胞极化，促进BMSCs增殖和迁移，最终修复软骨组织。单细胞测序揭示sEV-p重塑免疫微环境，抑制急性炎症（sEVs通过减少中性粒细胞浸润）的同时，更倾向于长期修复模式（抑制焦亡、促进软骨再生、抑制纤维化、激活免疫调节）。巴马小型猪模型进一步验证了其临床转化潜力。

**研究结论**
在OA发展过程中，细胞焦亡导致严重炎症、软骨损伤和降解，引发阻碍组织修复的恶性级联反应。尽管细胞焦亡在OA发展中至关重要，但针对该靶点的策略仍然有限。本研究基于“减少活化Caspase-1对内源性GSDMD的切割可缓解GSDMD-N诱导的细胞焦亡”这一分子机制，合成了模拟GSDMD蛋白C端及其四肽识别位点的序列，并将其偶联于小细胞外囊泡（sEVs-p）表面进行递送。应用这些囊泡可在体外有效抑制细胞焦亡，增强BMSCs的增殖和迁移。此外，在临床前小鼠和猪模型中应用sEV-p可显著延缓OA发展并改善术后恢复。利用前沿的单细胞RNA测序，本研究还揭示了sEV-p治疗后小鼠免疫景观的重塑，为未来研究提供了有价值的数据库。因此，本研究确立了靶向细胞焦亡治疗OA的概念验证，并为工程化sEVs用于OA治疗铺平了道路。