剪切激活的von Willebrand因子捕获细胞外囊泡以促进血小板活化和转移

《Journal of Extracellular Vesicles》：Shear-Activated von Willebrand Factor Captures Extracellular Vesicles to Promote Platelet Activation and Metastasis

　　

血浆蛋白越来越被认为是循环中细胞外囊泡（EV）行为的关键调节因子。然而，von Willebrand因子（vWF）——血液中最大的多聚体糖蛋白，也是唯一受剪切激活的血蛋白——在此背景下受到的关注甚少。在高剪切应力下，vWF从紧凑的球状构象转变为延展的粘附构象。尽管在疟疾、COVID-19和癌症等疾病中，升高的血浆vWF水平与高凝状态相关，但研究人员尚未系统研究其在生理流动下与EV或细胞的相互作用。在此，研究人员表明，剪切激活的vWF作为一个尺寸选择性的分子过滤器，优先捕获小于约4μm的物体，包括血小板和肿瘤来源的EV，而排除较大的细胞。尽管完整的肿瘤细胞在生理流动下不直接结合vWF，但EV和血小板与延展vWF的协同结合促进了血小板聚集，进而捕获循环肿瘤细胞并促进转移扩散。研究人员的发现揭示了vWF作为一个剪切依赖的EV结合蛋白的新作用，该蛋白将EV和血小板聚集在一起以增强凝血和转移。这些EV–vWF–血小板聚集体可能作为有前景的生物标志物或治疗靶点，用于预防癌症及其他血栓炎症性疾病中的高凝状态。

**论文解读**

**研究背景与问题**

血管性血友病因子（von Willebrand factor, vWF）是血液中最大的多聚体糖蛋白，在凝血和止血中起核心作用。vWF由巨核细胞和内皮细胞合成，在血管应激或损伤时释放，并在剪切应力作用下从球状构象伸展为纤维状，暴露出A1结构域，从而介导血小板粘附。然而，vWF与循环中其他成分（如细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs））的相互作用尚未被系统研究。EVs是由多种细胞（包括血小板、白细胞和肿瘤细胞）释放的纳米级囊泡，携带组织因子（tissue factor, TF）等促凝物质。临床研究表明，EVs和vWF共同作为高凝状态的替代标志物，但两者在剪切流下的协同作用机制尚不清楚。此外，剪切应力对vWF伸展的促进作用与对粘附细胞施加的拖曳力之间的平衡，以及不同尺寸颗粒（如EVs、血小板、肿瘤细胞）与vWF结合的能力差异，均未得到阐明。因此，本研究旨在系统探讨剪切应力如何调控vWF对循环组分的捕获，并揭示EV-vWF相互作用在血小板活化、血栓形成及肿瘤转移中的功能意义。该论文发表在《Journal of Extracellular Vesicles》。

**主要技术方法**

研究人员采用微流体装置结合活细胞荧光显微镜，在生理剪切应力下（10–80 dyn/cm²）观察vWF包被表面与不同尺寸颗粒（聚苯乙烯颗粒、血小板、EVs、肿瘤细胞）的相互作用。利用野生型及A1结构域缺失（ΔA1）vWF，结合肝素修饰颗粒和硫酸乙酰肝素（heparan sulfate, HS）缺陷型EVs，通过力梯度实验和恒定剪切实验分析结合动力学。采用表面声波（surface acoustic wave, SAW）生物传感器量化实时结合亲和力。在体内，使用野生型小鼠和vWF敲除（vWF^?/?）小鼠模型，通过静脉注射荧光纳米颗粒或肿瘤细胞及EVs，结合免疫荧光染色评估vWF纤维对颗粒的捕获及肺转移灶形成。此外，利用超分辨率STED显微镜、透射电子显微镜（TEM）和纳米颗粒追踪分析（NTA）表征EVs尺寸和标志物。样本来源包括B16F10黑色素瘤细胞及其衍生EVs，以及人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和人类黑色素瘤细胞系（MV3、MeWo、A2058）。

**研究结果**

**3.1 血小板与vWF的结合依赖于剪切应力**
研究人员通过微流体力梯度实验发现，在vWF包被表面上，血小板粘附随剪切应力增加而增强，在60 dyn/cm²时结合率达到峰值，80 dyn/cm²时因拖曳力超过粘附力而下降。血小板呈“珍珠串”状排列，表明vWF伸展并暴露A1结构域。

**3.2 伸展的vWF优先结合小尺寸颗粒**
使用不同直径（0.5、1.8、4、10 μm）的肝素包被聚苯乙烯颗粒进行力梯度实验，结果显示0.5和1.8 μm颗粒结合随剪切应力增加而增强，4 μm颗粒仅在40 dyn/cm²以上微弱结合，10 μm颗粒完全不结合。A1结构域缺失（ΔA1 vWF）则完全消除颗粒结合。在血小板存在下，小颗粒（0.5 μm）结合最多，10 μm颗粒无结合。体内实验表明，静脉注射的荧光纳米颗粒（~0.2 μm）在野生型小鼠肿瘤血管中沿vWF纤维积累，而在vWF^?/?小鼠中无积累。

**3.3 理论计算颗粒与vWF包被表面的结合**
研究人员建立理论模型，考虑粘附力（F_ad）与拖曳力（F_drag）的平衡。计算结果显示，小颗粒（0.5、1.8 μm）结合效率最高，10 μm颗粒不结合；4 μm颗粒结合弱。进一步的尺寸范围计算表明，稳定粘附的临界尺寸介于1.6–3.2 μm之间，与血小板尺寸一致。

**3.4 黑色素瘤细胞来源EVs的表征**
B16F10细胞来源EVs经Western blot、NTA、TEM、STED等表征，确认富含CD81、CD9、flotillin-1，且尺寸范围在118.8–324.9 nm，远小于血小板（2–4 μm），符合vWF捕获范围。

**3.5 EVs而非完整细胞结合伸展的vWF**
微流体实验显示，B16F10细胞不直接结合vWF，而EVs在血小板附近沿vWF纤维积累。STED显微镜揭示EVs以聚集形式存在。不同黑色素瘤细胞系（MV3、MeWo、A2058）来源EVs均能结合vWF。在HUVEC单层上，组胺刺激释放vWF后，EVs直接结合vWF纤维，而不结合未刺激的HUVECs。

**3.6 EVs与vWF的结合依赖于A1结构域和HS**
与野生型EVs相比，HS缺陷型（Ext1^?/?）EVs与vWF的结合显著降低（约两倍）。SAW生物传感器实验证实，HS缺陷型EVs结合相移减小。A1结构域缺失同样降低EVs结合，ADAMTS13（vWF切割酶）可消除EV积累。这些结果表明，EVs通过HS与vWF A1结构域相互作用。

**3.7 EVs与vWF纤维的结合支持血小板聚集**
在含有血浆和CaCl₂的灌注条件下，TF阳性EVs促进血小板活化（P-selectin表达增加）和聚集，而TF敲低（shTF）EVs的作用显著减弱。使用ΔA2 vWF（抵抗ADAMTS13切割）可增强EV和血小板结合。在血浆存在下，临界剪切应力从60 dyn/cm²降低至约40 dyn/cm²，表明血小板聚集形成。

**3.8 活化血小板在EV诱导的聚集体中捕获肿瘤细胞并促进转移**
在微流体系统中，EV诱导的血小板聚集可捕获循环肿瘤细胞，形成血栓样结构。在胶原凝胶实验中，活化血小板促进肿瘤细胞伸展和迁移。体内实验显示，在野生型小鼠中，共注射野生型EVs可显著增加肺转移灶数量，而TF^?/? EVs或Ext1^?/? EVs的促转移作用减弱。在ADAMTS13^?/?小鼠中，EVs导致总转移面积显著增大，出现超大转移灶。

**讨论与结论**

**讨论**
本研究揭示了vWF纤维在剪切流下作为尺寸选择性支架，优先捕获EVs而非肿瘤细胞。EVs通过HS与A1结构域结合，定位在血小板附近，使TF局部富集，促进血小板活化和聚集，形成血栓样结构，进而捕获循环肿瘤细胞并促进转移。理论计算与实验一致表明，颗粒尺寸是关键决定因素，血小板尺寸（2–4 μm）处于最佳粘附范围。EVs虽小但结合效率低于血小板，因其刚性高、不易变形。血小板在剪切下可扁平化增大粘附面积。此外，TF阳性EVs比例低，但局部聚集足以驱动凝血级联。该机制不仅限于癌症，可能参与其他高凝疾病（如COVID-19、菌血症）。HS模拟物或可阻断EV-vWF结合，作为潜在治疗策略。vWF纤维网络还可能作为血管内纳米颗粒递送的天然支架。

**结论（翻译原文Conclusion部分）**
总之，研究人员的研究表明，EVs与伸展vWF的结合可激活血小板并触发血小板聚集。这些血栓样聚集体可捕获循环肿瘤细胞并显著促进转移性生长。通过阐明EV-vWF相互作用的分子和生物物理机制，研究人员的研究可能支持未来开发针对癌症患者及其他以高凝状态为特征的疾病中EV介导血栓形成的治疗方法。此外，研究人员的发现强调了EVs和vWF作为评估血栓风险及监测疾病进展的潜在生物标志物的临床相关性。