使用淋巴结寻踪剂64Cu标记的革兰阴性菌胞外囊泡进行正电子发射断层扫描（PET）的脑脊液淋巴引流

《Journal of Extracellular Vesicles》：Lymphatic Drainage of Cerebrospinal Fluid Using Lymph Node Seeker 64Cu-Labeled Gram-Negative Bacterial Extracellular Vesicles With Positron Emission Tomography (PET)

　　

脑脊液（CSF）通过椎旁淋巴结引流至全身淋巴系统。在鼠中，浅表及深部颈淋巴结收集CSF，但确切且定量的路径尚不清楚。近期，研究人员通过鞘内注射[⁶⁴Cu]Cu-白蛋白正电子发射断层扫描（PET）连续成像，同时可视化了颈、骶和髂淋巴结。椎旁淋巴结可能作为前哨淋巴结监测CSF、脑和脊髓。研究人员使用⁶⁴Cu标记的大肠杆菌胞外囊泡（即外膜囊泡，OMVs）作为淋巴结寻踪剂进行鞘内注射，并定量了鼠脑和脊髓轴线上不同椎旁淋巴结的差异量。定量结果显示，77.3%位于浅表及深部颈淋巴结，11.4%位于腹/盆腔淋巴结，11.3%位于骶淋巴结。点击标记的[⁶⁴Cu]Cu-OMVs经连续定量显示被引流至淋巴结并停留。颈淋巴结引流了大部分含OMV的CSF，这与鼠脑（70%）和脊髓的表面积成正比。研究人员提出，所有椎旁淋巴结监测脑和脊髓的分段区域，作为中枢神经系统的即刻前哨淋巴结。

**研究背景与问题**
脑脊液（CSF）通过淋巴系统引流至全身循环，这一过程对清除脑代谢废物和免疫调节至关重要。近年来，脑膜淋巴管和椎旁淋巴结被确认为CSF引流的关键结构，但引流路径的精确解剖定位和定量比例仍不明确。现有研究主要依赖荧光染料、MRI对比剂或放射性标记白蛋白，但这些方法存在分辨率不足、示踪剂易从淋巴结外泄或难以定量等问题。此外，不同分子（如小分子、大分子、胞外囊泡，EVs）在CSF引流中的行为差异尚不清楚。因此，急需一种能稳定保留在淋巴结内、可全身定量成像的示踪剂，以揭示CSF向各椎旁淋巴结分流的精确比例。

**研究内容与结论**
研究人员采用大肠杆菌来源的胞外囊泡（外膜囊泡，OMVs）作为淋巴结寻踪剂，通过点击化学标记⁶⁴Cu，经鞘内注射后利用正电子发射断层扫描（PET）进行连续定量成像。结果显示，77.3%的放射性积聚于浅表及深部颈淋巴结，11.4%分布于腹/盆腔淋巴结（包括胃、胰十二指肠、腰主动脉、内侧髂淋巴结），11.3%分布于骶淋巴结。该分布与脑和脊髓的表面积比例（脑约70%，脊髓约30%）高度一致，提示椎旁淋巴结按中枢神经区域分段监测CSF。研究首次实现了对CSF引流至各椎旁淋巴结的绝对定量，并证实OMVs可被淋巴结有效捕获而不外泄，为研究CSF动力学提供了稳定平台。论文发表于《Journal of Extracellular Vesicles》。

**主要关键技术方法**
（1）OMVs制备：从大肠杆菌BL21(DE3) ΔmsbB突变株培养上清中，经切向流过滤、金属沉淀、尺寸排阻色谱纯化获得OMVs。
（2）点击化学标记：先将DBCO-NHS酯与OMVs表面蛋白共价偶联，再与预螯合⁶⁴Cu的NOTA-N₃通过炔-叠氮点击反应连接，标记效率达99%，免去纯化步骤。
（3）PET成像：采用GENISYS4和SimPET系统对小鼠进行口服、皮下、肌内、腹腔、静脉及鞘内给药后的连续静态扫描（3–10 min），并基于感兴趣区定量计算各淋巴结的放射性百分比。
（4）样本队列：7–8周龄雄性C57BL/6小鼠，每组3只，共6种给药途径（n=18）。

**研究结果**
**2.1 OMV标记与⁶⁴Cu**
通过动态光散射、纳米颗粒追踪分析、SDS-PAGE和免疫印迹验证，标记前后OMVs的粒径（约20–23 nm）、蛋白组成（外膜蛋白OmpA富集，胞质蛋白FtsZ缺失）及免疫活性（诱导RAW264.7细胞释放TNF-α和IL-6）均无显著变化，证实标记过程不影响OMVs特性。

**2.2 口服给药后⁶⁴Cu标记OMVs在胃肠道的分布**
口服后放射性仅局限于胃肠道管腔，48 h内完全排出，未跨越黏膜上皮屏障，表明OMVs不能经口服途径被系统性吸收。

**2.3 皮下和肌内给药后⁶⁴Cu标记OMVs的分布差异**
皮下注射后，放射性在注射部位持续长达48 h，并通过皮内回流缓慢扩散至远处淋巴结，仅后肢注射可见胸导管出口信号。肌内注射后，杂质[⁶⁴Cu]Cu-NOTA-N₃在2 h内迅速经肾排泄，而OMVs自身被局部淋巴结捕获，呈链式递减摄取。

**2.4 腹腔给药后⁶⁴Cu标记OMVs沿淋巴通道的分布**
腹腔注射后，OMVs在腹腔内广泛扩散，通过膈肌淋巴管进入胸腔，并被纵隔及颈淋巴结捕获，放射性持续48 h无变化。

**2.5 静脉给药后⁶⁴Cu标记OMVs在脾和肝的捕获**
静脉注射后，脾和肝的吞噬系统迅速摄取几乎所有OMVs，游离[⁶⁴Cu]Cu-NOTA-N₃经肾排泄，肝代谢产物通过胆道进入肠道，脾和肝放射性持续至24 h。

**2.6 鞘内给药后⁶⁴Cu标记OMVs的生物分布**
鞘内注射后，放射性从腰椎CSF空间上行至基底池，1 h内出现于10个椎旁淋巴结（双侧浅表及深部颈、胃、胰十二指肠、腰主动脉、内侧髂、双侧骶淋巴结），并持续至24 h。定量显示：颈淋巴结（浅表29.3%+深部48.0%）共计77.3%，腹/盆腔淋巴结11.4%，骶淋巴结11.3%。各淋巴结的放射性累积与CSF输出量成正比，且无系统性再分布，证实这些淋巴结是CSF引流的第一站。

**讨论与结论**
**讨论**：研究证实OMVs作为淋巴结寻踪剂，可稳定驻留于CSF引流的第一站淋巴结，克服了白蛋白易外泄的缺陷。通过对比不同给药途径，阐明了OMVs在淋巴系统中的捕获特性，并指出该特性与哺乳动物细胞来源的胞外囊泡（ENVs）存在差异，强调EVs行为的异质性。此外，鞘内注射后CSF中OMVs的清除速度慢于白蛋白，这有利于定量成像。基于脑和脊髓表面积（脑占70%）与颈淋巴结引流比例（77.3%）的近似性，研究人员提出CSF引流遵循“需求伴随引流”的规律，即脑和脊髓的代谢废物经CSF通过椎旁淋巴结分段排出。个体差异（如腹/盆腔淋巴结变异、骶淋巴结不对称）反映了生理多样性。

**结论翻译**：基于这些关于淋巴结和中枢神经系统位置的观察，研究人员提出脑和脊髓通过蛛网膜屏障细胞层的间隙/出口/缺陷，将废物经CSF释放至淋巴系统。研究人员建议，CSF-淋巴引流遵循间质-淋巴相互作用的一般规律，即“需求伴随引流”。脑和脊髓的废物供应要求CSF清除，这需要表面通过。尽管缺乏实测的硬脑膜表面积，但通过鼠脑和脊髓重量估算的表面积（脑占70%）与颈淋巴结摄取比例（77.3%）相似。因此，颈淋巴结不仅接收颈髓的引流，也接收脑的引流。此外，局部淋巴结条件（位置、潜在炎症）可能影响引流比例。腹/盆腔淋巴结变异最大，骶淋巴结常显示不对称，反映了个体生理差异。OMVs影响淋巴结的机制及不同来源EVs的淋巴结寻踪能力仍有待阐明。该成像方法可用于评估疾病修饰治疗对CSF-淋巴引流的影响。尚需进一步研究以区分OMV特异性行为与通用EV相关转运机制，并在同龄哺乳动物EVs条件下验证发现。