腺病毒载体介导的体内末端切割供体DNA对新生苯丙酮尿症小鼠的敲入治疗

《The Journal of Gene Medicine》：Adenovirus Vector-Mediated In Vivo Knock-in Treatment of Neonatal Phenylketonuria Mice Using Terminally Cleaved Donor DNA

　　

背景：腺病毒载体（AdV）被广泛使用，与腺相关病毒载体相比，具有大插入容量的优势。然而，由于效率低，AdV在基因组编辑敲入策略中很少被使用。方法：研究人员开发了新型AdV，其携带一个非常大的3.7 kb供体DNA片段和六个或八个多路gRNA表达单元，用于CRISPR/Cas9介导的敲入，以纠正Pahenu2苯丙酮尿症小鼠模型中的苯丙氨酸羟化酶（Pah）基因。这些AdV与表达天然Cas9或Cas9切口酶（Cas9n）的AdV共同感染Hepa1–6细胞或体内肝细胞，以进行双切口切割。结果：在使用Cas9和Cas9n的情况下，均观察到携带3.7 kb供体DNA和六个靶向细胞基因组gRNA单元的AdV的体外敲入，尽管效率较低。因此，研究人员生成了携带额外两个gRNA单元的AdV，这些单元通过天然Cas9或Cas9n切割AdV基因组中的供体DNA末端。两种载体的敲入效率均增加约两倍，并在无筛选条件下天然Cas9达到最高8%。新生苯丙酮尿症模型小鼠被静脉注射敲入AdV与天然Cas9 AdV。尽管通过同源重组发生的敲入效率仅约1%的肝细胞中，但血液苯丙氨酸水平降低了高达30%。此外，在AdV基因组中供体DNA末端的切割位点与细胞基因组中靶位点之间观察到了由非同源末端连接产生的意外片段。结论：可以通过切割供体DNA末端来提高AdV的敲入效率，尽管需要避免双链断裂末端之间的非同源末端连接。

苯丙酮尿症（PKU）是一种由苯丙氨酸羟化酶（PAH）基因突变引起的常染色体隐性遗传代谢疾病，导致PAH功能缺失，进而引发高苯丙氨酸血症，造成严重神经损伤。CRISPR/Cas9技术是基因修饰和遗传病治疗的有力工具，但实现高效的同源重组修复（HDR）介导的基因敲入仍是挑战。腺相关病毒（AAV）载体是目前最常用的基因递送工具，但其包装容量有限（约4.5 kb），限制了同源臂长度，且存在随机整合和高生产成本等问题。相比之下，腺病毒载体（AdV）具有高达8 kb的包装容量，且基因组整合极少，生产成本低，但此前在基因组编辑敲入中应用较少，主要因为效率低。本研究旨在利用AdV的大容量优势，开发携带大片段供体DNA和多路gRNA的AdV，并通过切割供体DNA末端来提高敲入效率，以治疗PKU小鼠模型。该研究发表在《The Journal of Gene Medicine》上，为AdV在基因组编辑治疗中的应用提供了重要进展。

研究人员开展的研究包括：构建了携带3.7 kb供体DNA（含正常Pah外显子7）和六个gRNA表达单元的AdV（Ax6g和Ax3DN），并在此基础上添加两个额外gRNA单元以切割供体DNA末端（Ax6g-cut和Ax3DN-cut）。使用这些AdV与表达Cas9或Cas9切口酶（Cas9n）的AdV共同感染小鼠肝细胞瘤Hepa1-6细胞进行体外实验，并对新生Pahenu2 PKU小鼠（来自C57BL/6背景）进行静脉注射治疗。通过PCR、StuI酶切和TIDER分析等方法检测敲入效率，并分析NHEJ事件。主要技术方法包括：利用Tetraplex-guide Tandem方法构建多路gRNA表达单元；将3.7 kb供体DNA插入AdV基因组E4区；通过同源重组在293细胞中生产AdV；使用实时PCR滴定病毒滴度；对小鼠肝细胞DNA进行PCR扩增和StuI酶切检测敲入；采用TIDER分析评估HDR效率；使用T7EI检测indel。

**3.1 敲入AdV的构建**
研究人员构建了AxPah-6g（Ax6g）和AxPah-3DN（Ax3DN）两种载体，均携带3.7 kb供体DNA和六个gRNA表达单元。Ax6g表达六个相同的gRNA d（通过体外效率筛选获得最高效率），与Cas9共感染；Ax3DN表达三种双切口对（a/c、a/d、b/e），与Cas9n共感染。供体DNA引入四个人工碱基改变（不改变氨基酸），创造StuI酶切位点，并防止被gRNA切割。通过SmaI酶切分析显示，超过70%的AdV保留了完整的六个gRNA单元，未发生显著缺失。

**3.2 使用AdV检查体外敲入效率**
在Hepa1-6细胞中，Ax6g联合AxCBCas9（MOI 100）时，通过PCR检测到左侧和右侧同源臂的敲入，全区域敲入效率为4%。Ax3DN联合Cas9n时，敲入效率仅0.7%，显著低于天然Cas9。

**3.3 从AdV切割供体DNA提高敲入效率**
添加两个gRNA单元切割供体DNA末端的Ax6g-cut和Ax3DN-cut载体，在体外敲入效率显著提升。Ax6g-cut联合Cas9在MOI 100时效率达8%，较Ax6g的4%提高两倍；Ax3DN-cut联合Cas9n效率达3%，较Ax3DN的0.7%提高四倍。调整载体比例（Ax6g-cut与Cas9载体比例9:1，总MOI 200）可进一步提高效率至12.6%。TIDER分析与PCR/StuI结果一致，NHEJ抑制剂（香兰素、SCR7）或HDR促进剂（L755507）仅轻微增加效率。

**3.4 Pahenu2小鼠的体内敲入治疗检查**
五只新生小鼠经面部静脉注射Ax6g-cut（3×10⁸ rVT）和AxCBCas9（1×10⁸ rVT）。6周后，一只小鼠血清苯丙氨酸（Phe）水平降至1200 μM以下（经典PKU阈值）。8周时再次静脉注射（6×10⁹和2×10⁹ rVT），并每日腹腔注射香兰素。5周后，三只小鼠Phe水平降低约30%，效果显著（p=0.03）。13周时，肝脏DNA分析显示左侧和右侧区域敲入效率约1%，但全区域敲入效率过低而无法定量。同时检测到四种NHEJ事件（NHEJ 1-4），其中NHEJ 1-3效率约1%，与预期敲入效率相当。T7EI分析显示靶位点indel效率约20%-26%，TIDER分析为28%-42%。

讨论部分总结了AdV大容量优势（可携带长同源臂）和末端切割策略的可行性，但指出体内肝细胞敲入效率仍低（<1%），且NHEJ事件导致非预期片段。第二代给药有效可能归因于新生小鼠免疫系统未成熟、避免pIX基因泄漏表达等因素。Cas9n双切口策略虽能降低脱靶，但敲入效率远低于天然Cas9，需进一步优化gRNA对间距和方向。切割供体DNA末端使效率提升，但引发了NHEJ连接，破坏了编码区。未来需提高HDR效率并减少NHEJ。研究结论翻译如下：总之，研究人员推进了AdV在基因组编辑治疗中的临床前开发。为了克服AdV的低敲入效率，研究人员开发了携带供体DNA的AdV，该DNA不仅具有大同源臂，而且其末端被设计为可切割的。尽管该方法在PKU小鼠模型中产生了部分治疗效果，但并未实现稳健的疗效。然而，本文描述的AdV改进为未来开发有效的敲入治疗AdV提供了宝贵的基础。