电离辐射获得性耐受相关候选生物标志物的蛋白质组学鉴定

《Radiation Physics and Chemistry》：Proteomic identification of candidate biomarkers associated with acquired tolerance to ionizing radiation

　　

辐射抵抗是一个重大问题，导致放射治疗失败和肿瘤复发。本研究旨在选择一株X射线抗性酿酒酵母（S. cerevisiae）菌株，以评估在高电离辐射暴露下失调的蛋白质，旨在鉴定候选分子生物标志物。将野生型（wt）菌株暴露于递增剂量的X射线，直至获得抗性菌株。评估存活率，并通过质谱法进行蛋白质组学分析。抗性细胞表现出比wt菌株高9.38倍的抗性。鉴定出若干失调蛋白质。这些发现表明，高剂量下获得性辐射抵抗与GAPDH和ENO1表达增加相关，它们被提议作为与获得性辐射耐受相关的候选分子生物标志物，有待进一步功能验证。数据可通过ProteomeXchange（标识符PXD074114.1）获取。

电离辐射（ionizing radiation, IR）是肿瘤治疗的重要手段，但肿瘤细胞中辐射抵抗的获得是导致放疗失败和复发的关键难题。尽管已有研究阐明DNA损伤修复（如非同源末端连接nonhomologous end joining, NHEJ和同源重组homologous recombination, HR）及抗氧化系统等机制，但获得性抵抗的多因素本质仍未完全阐明。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）因其与人类基因的高度保守性，成为研究辐射抵抗分子机制的理想模型。本研究旨在通过蛋白质组学方法，鉴定与高剂量X射线暴露相关的候选生物标志物，为理解获得性辐射耐受提供分子框架。研究人员通过重复X射线暴露（累积16 kGy）筛选出一株抗性菌株X-RayR，并利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）结合TMT定量蛋白质组学，分析差异表达蛋白，最终提出GAPDH和ENO1作为候选生物标志物。该研究发表在《Radiation Physics and Chemistry》。

在关键技术方法方面，研究人员采用以下流程：使用Andrex SMART 200E X射线机（200 kV，4.5 mA，剂量率10.08 Gy/min）对野生型（wt）酿酒酵母WS8105-1C进行7个循环的递增剂量照射（1 kGy至3 kGy），累积剂量16 kGy，历时107天，获得X-RayR菌株。通过克隆形成存活实验和负指数模型拟合生存曲线，计算放射生物学参数（D₃₇、D₁₀、D₁）评估抗性水平。蛋白质组学分析采用TMT 2plex标记，经Easy nLC 1200 UHPLC分离，Q Exactive HF-X质谱检测，数据通过Proteome Discoverer 2.4平台搜索SwissProt数据库（S. cerevisiae S288c），以1% FDR过滤。差异蛋白筛选标准为倍数变化>2（上调）或<0.5（下调），且Benjamini-Hochberg校正后p<0.01。随后进行Gene Ontology（GO）富集、KEGG通路分析、Metascape聚类及STRING蛋白互作网络分析，并查找人源同源基因（SGD数据库和RadBioBase数据库）。

研究结果部分：
**3.1 辐射抗性菌株的筛选**：通过7个照射周期，X-RayR菌株的恢复时间逐渐缩短，表明获得适应性和抗性。最终获得稳定抗性菌株，命名为WS8105-1C-16000X-RayR（简称X-RayR）。
**3.2 筛选过程中的生长速率和平台期到达时间**：与wt菌株相比，X-RayR菌株在后期循环中生长速率加快（最高达1.874天^-1），到达平台期时间缩短，显示适应能力增强。
**3.3 X-RayR菌株的获得性抗性水平**：负指数模型拟合显示，X-RayR菌株的D₁₀值为1258.19 Gy，是wt菌株（134.20 Gy）的9.38倍，差异具有统计学意义（p<0.001）。滴板试验进一步验证了抗性。
**3.4 生长、细胞周期和蛋白含量的表征**：两种菌株在液体培养基中生长曲线相似，但X-RayR菌株细胞周期分布发生改变——G0/G1期比例降低（49.27% vs 72.60%），S期（23.73% vs 8.00%）和G2+M期（17.07% vs 10.61%）比例升高，提示S期和G2/M检查点参与DNA修复。X-RayR菌株总蛋白含量更高（1.24 vs 0.61 μg/μl，p<0.005），可能与细胞体积增大相关。
**3.5 蛋白质组分析、差异表达蛋白鉴定及富集分析**：共鉴定1226种蛋白，其中848种满足严格标准。火山图筛选出24个上调蛋白（倍数>2，校正p<0.01）和29个下调蛋白（倍数<0.5，校正p<0.01）。上调最显著的是甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH，由TDH2编码）和烯醇化酶1（ENO1，由ENO1编码），倍数分别为4.409和4.224。GO富集分析显示上调蛋白主要富集于糖酵解/糖异生、碳代谢等过程；下调蛋白主要富集于核糖体结构和翻译。
**3.6 富集本体簇和蛋白互作分析**：Metascape聚类和MCODE算法识别出核心上调蛋白（TDH2、ENO1、PGI1、FBA1、TDH3、ENO2）和核心下调蛋白（RPL34B、RPL25、RPL7A、RPL10、RPL16A、RPS5、RPP1A、RPS17B）。STRING分析表明上调蛋白紧密互作，主要参与糖酵解/糖异生通路（FDR=4.91×10^-11）；下调蛋白全部与核糖体相关。
**3.7 代谢通路改变**：KEGG通路进一步显示，上调核心蛋白促进磷酸烯醇式丙酮酸合成，增强糖酵解和碳代谢；下调蛋白主要影响核糖体大小亚基，可能抑制翻译。
**3.8 人源同源基因及数据库比较**：上调核心蛋白均有人源同源基因，如TDH2对应GAPDH，ENO1对应ENO1，PGI1对应GPI等。下调基因如RPL34B对应RPL34，RPL25对应RPL23A等。在RadBioBase数据库中未发现相关实验数据。

在讨论部分，研究人员指出，获得性辐射抵抗涉及多因素协同作用，而非单一通路调控。细胞周期向S期和G2/M期重分布有利于DNA损伤修复。上调蛋白集中参与能量代谢（糖酵解/糖异生、磷酸戊糖途径），提示抗性细胞进入一种新的高代谢状态；下调核糖体蛋白可能通过抑制雷帕霉素靶蛋白（TOR）信号通路，增强蛋白稳态，共同抵御辐射损伤。GAPDH和ENO1作为最显著上调的蛋白，其功能不仅限于糖酵解，还参与活性氧（ROS）调控和碱基切除修复，与临床肿瘤辐射抵抗相关。虽然本研究使用的极高剂量（16 kGy）与临床放疗剂量（1.8-3 Gy/次）有巨大差异，但人源同源基因的保守性表明其潜在临床价值。研究结论为：本研究所用X射线抗性筛选方法成功诱导出获得性高剂量辐射抗性，D₁₀抗性水平达wt菌株的9.38倍。蛋白质组学鉴定出24个上调蛋白和29个下调蛋白，其中TDH2/GAPDH和ENO1表达最高，被提议作为与获得性辐射耐受相关的候选生物标志物，需进一步功能验证。生物信息学分析揭示了通路水平的协调性和生物学合理性，为未来功能研究提供了分子框架。核心酵母基因（TDH2、ENO1）及其人源同源基因（GAPDH、ENO1）是鉴定肿瘤放射反应和预后分子标志物的良好候选者。