木质纤维素与富氨生物质联合厌氧共消化：基于先进复合生物强化接种物的研究

《Renewable Energy》：Anaerobic co-digestion of lignocellulose and ammonia rich biomasses using advanced composite bioaugmentation inocula

　　

摘要
木质纤维素和富氨生物质来源广泛，在甲烷生成方面具有巨大潜力，然而二者联合使用时常严重抑制厌氧消化（anaerobic digestion, AD）性能。本研究探索了生物强化（bioaugmentation）作为抵消木质纤维素和氨同步抑制效应的策略。以混合培养物和纯菌株（即Ruminococcus albus和Methanoculleus bourgensis）为基础，开发了由水解细菌和产甲烷古菌组成的复合微生物接种物。这些培养物经驯化以适应高浓度木质纤维素（3 g VS L^-1）和氨（4 g NH₄⁺-N L^-1）。为评估适合未来实际商业应用的长期保藏方法，将驯化后的接种物分别进行冻干或凝胶固定化处理。随后，研究人员在高木质纤维素和/或氨水平条件下的批次反应器中评估了其性能。含有驯化M. bourgensis和R. albus的冻干复合接种物实现了最高甲烷产量，达到195 mL CH₄ g^-1 VS，是其凝胶固定化对应物的六倍。此外，源自驯化混合接种物的冻干复合接种物表现出快速的初始甲烷产生响应，其甲烷产量比相应的非生物对照高出235.1%。本研究首次证明了将水解微生物和产甲烷微生物相结合、并驯化至严苛木质纤维素和氨水平的复合生物强化接种物可成功开发，且适用于长期储存和按需使用，为提升AD工艺稳定性和效率提供了广阔前景。

**论文解读：利用复合生物强化接种物缓解木质纤维素与氨联合抑制的研究**

**一、研究背景**

随着全球对可再生能源需求的持续增长，厌氧消化（Anaerobic Digestion, AD）作为一种成熟的废弃物资源化和可再生能源技术，在全球范围内得到广泛应用。欧洲在沼气领域进展显著，2023年沼气与生物甲烷总产量达到220亿立方米。然而，沼气产业的持续发展依赖于充足且稳定的生物质原料供应。木质纤维素类生物质是全球产量最丰富的底物，年产约1815亿吨，但有效利用率极低；同时，来源于食品和畜禽废弃物的富蛋白底物也大量存在。这两类底物均具有较高的甲烷生成潜力，将其作为共底物应用于沼气工程具有极大吸引力。然而，二者联合使用在实际工程中面临严峻挑战：木质纤维素水解速率缓慢且不彻底，而氨对厌氧微生物具有毒性。当两类底物共同使用时，易引发“抑制稳态”，即一种稳定但次优的运行状态，在此状态下甲烷产量损失可超过30%。这不仅限制了能源回收和经济效益，还因有机物降解不完全而增加环境负担。因此，亟需开发能够同时缓解木质纤维素和氨抑制效应的有效策略。

**二、研究内容**

针对上述问题，本研究旨在开发并评估经长期储存的、耐受木质纤维素和氨的复合接种物，以强化富含木质纤维素和氨底物的AD过程。研究人员将混合培养物和纯培养物（包括水解性细菌Ruminococcus albus和产甲烷古菌Methanoculleus bourgensis）逐步驯化至逐渐升高的木质纤维素和氨浓度，然后分别通过冻干和凝胶固定化两种方式进行保存，并在高抑制性条件下评估其生物强化效率。该研究首次尝试构建同时应对木质纤维素和氨抑制的复合接种物，并系统比较了两种保藏方法的优劣。研究结果为实现按需、快速、高效的AD过程强化提供了可靠的技术途径。

**三、主要技术方法**

本研究采用了以下关键技术方法：
1. 混合及纯培养物的梯度驯化：将厌氧接种物和两种纯菌株分别暴露于逐步升高的氨（最高4 g NH₄⁺-N L^-1）和/或木质纤维素（以小麦秸秆为代表，最高3 g VS L^-1）浓度下，以获得具有耐受性的驯化微生物群落。接种物来源于希腊Lagadas沼气厂的中温连续厌氧反应器。
2. 冻干保藏技术：在冻干保护剂（脱脂奶粉，终浓度10%）存在下，于≤-80℃冷凝器温度和0 torr真空度下对驯化接种物进行72小时冻干处理，制备五种冻干生物强化接种物。
3. 凝胶固定化保藏技术：将驯化接种物与琼脂溶液（终浓度10 g L^-1）混合，在无菌厌氧条件下制备凝胶固定化接种物。
4. 批次生物强化实验：在321 mL血清瓶中进行21组处理（每组三次重复）的批次消化实验，采用改性Gompertz方程对产甲烷动力学进行建模，并通过气相色谱分析沼气组成。

**四、研究结果**

**4.1 冻干接种物的生物强化效果**

冻干复合菌群处理在所有冻干处理中表现最佳，证明了不同微生物群之间的强协同相互作用。其中CON(RM)Lyo处理（驯化M. bourgensis和R. albus冻干复合物）累计甲烷产量最高，超过195 mL CH₄ g^-1 VS，显著高于其他所有处理。CON(AL)Lyo处理（氨驯化混合接种物+木质纤维素驯化混合接种物的冻干复合物）产量接近185 mL CH₄ g^-1，虽略低于CON(RM)Lyo，但初始响应更快，表明其在需要快速恢复的生物强化过程中具有潜力。与对应非生物对照相比，CON(RM)Lyo和CON(AL)Lyo的甲烷产量分别提高了146.5%和235.1%，证明冻干后微生物产甲烷活性得到良好保留。在单一驯化接种物中，MIX(L)Lyo（木质纤维素驯化冻干接种物）表现最佳，其甲烷产量比MIX(T)Lyo高30-35%，比MIX(A)Lyo高25%。

**4.2 凝胶固定化接种物的生物强化效果**

凝胶固定化处理中，MIX(L)Gel（木质纤维素驯化凝胶固定化接种物）的甲烷产量最高，但累计产量仍较低（约40 mL CH₄ g^-1 VS）。CON(RM)Gel（驯化M. bourgensis和R. albus凝胶固定化复合物）的产量分别比ALBGel和BOUGel高25%和30%，表明复合接种物在凝胶条件下也具有一定的协同效应。然而，所有凝胶固定化处理的甲烷产量均显著低于冻干处理，这归因于凝胶对底物扩散的限制及机械降解导致微生物代谢活性下降。

**4.3 冻干与凝胶固定化接种物的动力学比较**

最大比生长速率（μ_max）方面，冻干培养物普遍高于凝胶固定化对应物。例如MIX(T)Lyo的μ_max为0.0257 h^-1，是其凝胶对应物MIX(T)Gel（0.0088 h^-1）的三倍。最大甲烷产率（R_max）方面，MIX(L)Lyo达到68.32 mL CH₄ h^-1，比MIX(L)Gel（8.17 mL CH₄ h^-1）高出八倍。然而，冻干培养物的迟滞期（lag phase）普遍长于凝胶固定化培养物。ALBGel的迟滞期几乎可忽略（0.07 h），而ALBLyo的迟滞期长达6.14 h。这表明凝胶固定化支持更快的初始响应，而冻干确保了更高的长期产甲烷能力和微生物代谢活性。

**五、讨论与结论**

冻干与凝胶固定化两种保藏策略之间存在权衡关系。凝胶固定化使保藏培养物能够几乎即时再活化（迟滞期低至0.066 h），而冻干接种物虽表现出较长的迟滞期（最长6.14 h），但实现了显著更高的甲烷产量、产甲烷速率和微生物生长速率，表明冻干在储存期间保持了更好的结构和功能完整性。与对应BMP值的对比进一步证实，冻干混合菌群CON(RM)Lyo和CON(AL)Lyo分别达到BMP的68.30%和64.68%，而相应凝胶处理仅达到10.38%和7.89%。

本研究首次证明了包含水解细菌和产甲烷古菌的复合冻干接种物可成功用于同时缓解批次反应器中的氨抑制和木质纤维素降解瓶颈。冻干比凝胶固定化更有效地保留了微生物群落的代谢潜力和协同互作关系。混合冻干菌群的增强性能凸显了水解性和产甲烷微生物之间的强协同作用，可同时缓解AD过程中木质纤维素顽抗性和氨毒性这两大瓶颈。这些发现为在挑战性条件下放大生物强化策略以提高沼气产量提供了有前景的基础。研究结论表明，经过驯化的复合生物强化接种物结合冻干保藏技术，为提升AD工艺的稳定性和效率提供了切实可行的技术路径，未来研究需进一步优化再活化条件以缩短初始迟滞期。