《Journal of Integrative Plant Biology》：Engineered Yarrowia lipolytica inducing gene silencing confers control ability against gray mold in plants
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由坏死营养型真菌灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的植物灰霉病通过侵染超过1400种物种威胁全球粮食安全。灰葡萄孢对杀菌剂的抗性为其防控带来重大挑战。RNA干扰（RNAi）在病原体管理中展现出前景，但双链RNA（dsRNA）的高生产成本、差稳定性
由坏死营养型真菌灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的植物灰霉病通过侵染超过1400种物种威胁全球粮食安全。灰葡萄孢对杀菌剂的抗性为其防控带来重大挑战。RNA干扰（RNAi）在病原体管理中展现出前景，但双链RNA（dsRNA）的高生产成本、差稳定性及低效递送限制了其实际应用。本研究开发中，研究人员将解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株MP181-2作为新型RNAi平台，利用其定殖作物（番茄和苜蓿）叶际的能力，通过微生物诱导基因沉默（MIGS）实现dsRNA同步生产与病原靶向。经靶标筛选，研究人员鉴定出三个必需真菌基因BcRpd3、BcNat1和BcArd1，其沉默显著降低了灰葡萄孢致病性。研究人员进一步构建了靶向这三个基因的嵌合dsRNA分子（BcANR-dsRNA），其较单基因靶向表现出更优病害抑制效果。产生dsRNA的工程解脂耶氏酵母菌株能有效干扰灰葡萄孢中靶基因表达，表达BcANR-dsRNA的菌株（命名为Yl-dsANR）获得了抑制灰葡萄孢生长的能力。植株内试验证实Yl-dsANR成功干扰三个靶基因表达，导致不同宿主上真菌生物量减少及病斑发展降低。值得注意的是，盆栽植物叶面施用Yl-dsANR提供持久保护（5天内防效超70%）。该整合方法结合微生物生物防治优势与RNAi精确性，确立解脂耶氏酵母作为可持续作物保护的通用底盘。本研究亦为当前RNA农药开发局限提供有效解决方案，并为灰霉病管理提供可扩展、生态友好的化学杀菌剂替代方案。
研究背景方面，灰霉病由坏死营养型真菌灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起，可侵染1400余种植物，包括番茄、葡萄、苜蓿等，其气传分生孢子与植物残体腐生存活特性导致流行难以控制，且该菌对苯并咪唑类、琥珀酸脱氢酶抑制剂等多类杀菌剂已产生抗性，化学防治效力下降。RNA干扰（RNAi）基于双链RNA（dsRNA）沉默靶基因，具备精准、低抗性风险、环境可降解等优势，但dsRNA体外生产存在成本高、稳定性差、递送效率低三大瓶颈。既有微生物底盘如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）虽能体内合成dsRNA，但缺乏植物表面定殖能力；解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）作为非传统酵母，具有安全、遗传稳定、可定殖叶际与根际、兼具诱导系统抗性与直接拮抗等农用潜力，研究人员据此将其改造为同时生产并递送dsRNA的RNA农药活体平台，通过微生物诱导基因 silencing（MIGS）机制防控灰霉病。该论文发表于《Journal of Integrative Plant Biology》。
关键技术方法上，研究人员从番茄叶际分离获得MP181-2菌株并构建GFP标记株Yl-GFP以评估叶际定殖动态；通过siDirect 2.1预测约250 bp靶区段，体外转录合成单基因dsRNA及串联嵌合BcANR-dsRNA，在离体叶片进行初筛；利用pINA1312载体将正向靶序列—灰葡萄孢BctubB内含子—反向靶序列倒置重复（IR）盒整合入MP181-2基因组，获得产GFP-dsRNA株Yl-dsGFP与产BcANR-dsRNA株Yl-dsANR；以J2抗体dot blot、RT-qPCR检测胞内dsRNA，以GFP标记灰葡萄孢B05.10-GFP验证跨界沉默；结合离体叶片、盆栽整株、采后果实接种病原，用qPCR定量病原生物量及靶基因相对表达，评估防效与持效性。
研究结果部分，首先“A dsRNA chimera construct showed enhanced gray mold control effect”中，研究人员对5个候选基因设计约250 bp dsRNA，离体番茄叶显示靶向BcRpd3、BcNat1、BcArd1的单dsRNA抑病率40%–60%，将三序列串联的BcANR-dsRNA抑病率提升至81%，真菌生物量显著下降，RT-qPCR证实三靶基因同步下调，?苜蓿叶结果一致。“The Yarrowia lipolytica MP181-2 was capable of colonizing plant leaves”中，Yl-GFP喷布番茄与苜蓿叶后荧光信号持续至11天，qPCR与平板计数显示生物量5天达峰值后衰减，证明该株稳定定殖叶际。“Engineered Y. lipolytica producing dsRNA could silence B. cinerea target genes”中，工程株经PCR、RT-qPCR低Cq值及J2 dot blot确认产dsRNA，且酵母同源基因表达不受影响；B05.10-GFP菌丝经Yl-dsGFP发酵液处理6小时后GFP荧光、转录本与蛋白均下调，Yl-dsANR处理则特异性下调BcRpd3/BcNat1/BcArd1，证明活体跨界RNAi递送有效。“Engineered strain Yl-dsANR acquired the ability to suppress B. cinerea hyphae growth”中，双培养显示Yl-dsANR形成抑制圈，25%发酵液即抑制菌丝伸长，PDA含50% 4天发酵液菌落直径最小，优化出发酵4天、50%浓度条件。“Engineered strain Yl-dsANR inhibited the pathogenicity of B. cinerea on different hosts”中，离体番茄与苜蓿叶喷施50% 4天发酵液（含1–2×108 CFU/mL活细胞）后接种，Yl-dsANR处理病斑抑制率分别为68.3%±5.7%与69.7%±5.9%，病原生物量降低，三靶基因表达下调，番茄、葡萄、草莓采后果实防效同样优于对照。“Engineered strain Yl-dsANR showed durable biocontrol effect against gray mold in potted plants”中，盆栽番茄与苜蓿叶面预处理后接种，Yl-dsANR使病情指数较对照降低70.8%±1.6%与66.0%±0.8%；苜蓿叶喷雾后1–7天离体接种，前5天防效超70%，第7天仍达53.1%±2.6%，两周后植株株高与鲜重无异常，表明持效与生物安全。
讨论部分总结中，研究人员指出多基因嵌合dsRNA较单基因或混合单dsRNA可规避补偿效应与竞争抑制，提升防效并延缓抗性；将产dsRNA模块植入本就具生态位竞争的解脂耶氏酵母，使传统仅依赖营养竞争的酵母获得序列特异性直接抑菌能力，且不产毒特性保留；MIGS策略把dsRNA生产、递送、靶向统一于定殖微生物局部，省去外源纯化与制剂步骤，解脂耶氏酵母兼具真核加工保真、原核级增殖速度、叶际定殖与食品级安全，优于丝状真菌与细菌底盘。作者也阐明局限：工程株dsRNA分泌效率、自然田间定殖率、转基因微生物释放法规均需后续优化与田间验证。
结论翻译部分：研究人员开发了解脂耶氏酵母MP181-2工程平台，借叶际定殖经MIGS就地生产并递送嵌合BcANR-dsRNA，同步沉默灰葡萄孢BcRpd3、BcNat1、BcArd1三基因，离体与盆栽系统均证其显著降低病原生物量与病斑扩展，盆栽持效超5天且防效逾70%，采后果实亦有效，植株生长无不良影响；该活体RNA农药底盘把微生物生物防治与RNAi精准性合一，为灰霉病及更广谱病原管理提供可放大、低成本的化学杀菌剂替代路径。
