CCL5和GLUT1定义结直肠癌集体侵袭中的前导细胞

《The Journal of Pathology》：CCL5 and GLUT1 define leader cells in collective invasion of colorectal cancer

　　

在多种实体瘤中，侵袭和转移由前导细胞和跟随细胞组织的集体侵袭所促进。然而，在结直肠癌（CRC）中，指定前导细胞的生物标志物和机制仍不明确。本研究识别了前导细胞的生物标志物，并阐明了它们如何驱动CRC集体侵袭和转移。利用一个3D光转换CRC球体模型，研究人员分离了前导细胞和跟随细胞。转录组学、功能学和体内实验表明，前导细胞中的GLUT1、PLOD2和CCL5对集体侵袭是不可或缺的。CCL5激活PI3K/AKT信号通路，上调前导细胞中的GLUT1和PLOD2。此外，GLUT1和CCL5可作为CRC集体侵袭中前导细胞的特异性生物标志物，它们的共表达与不良预后相关。对GLUT1和CCL5-CCR5的药理学抑制损害了集体侵袭。CCL5和GLUT1可能定义前导细胞，并且作为代谢转变和胶原沉积的潜在关键调节因子，是CRC集体侵袭所必需的。? 2026 The Author(s). The Journal of Pathology published by John Wiley & Sons Ltd on behalf of The Pathological Society of Great Britain and Ireland.

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
肿瘤转移是一个多阶段过程，其中侵袭是关键门户。实体瘤的侵袭通过两种模式进行：单个细胞迁移和集体迁移。集体迁移形成多细胞链或团簇，在前导细胞引导下穿透周围基质。既往研究表明，聚集的肿瘤细胞比单个细胞具有更强的转移潜能，且集体迁移和侵袭是实体瘤进展的基础。在结直肠癌（CRC）中，前导细胞的生物标志物和驱动集体侵袭的机制尚不明确。本研究旨在识别CRC集体侵袭中前导细胞的特异性生物标志物，阐明其分子机制，从而揭示潜在治疗靶点和新策略。论文发表在《The Journal of Pathology》。

**主要技术方法**
研究人员构建了基于光转换蛋白（pDendra2-C）标记、I型鼠尾胶原3D培养和流式细胞分选（FACS）的实验系统：将CRC细胞系（SW620、HCT15）转染荧光质粒后形成多细胞球体，嵌入含I型胶原的3D凝胶中诱导集体侵袭，通过激光光转换前导细胞（绿色→红色荧光），随后用流式分选仪分选双阳性细胞（前导细胞）和单绿色细胞（跟随细胞）。样本来源包括SW620和HCT15细胞系，以及279例CRC患者病理组织（来自南方医院伦理委员会批准）。RNA-seq分析使用微转录组测序；功能实验包括Transwell迁移/侵袭、3D球体侵袭、皮下异种移植和原位接种模型；药理学抑制使用Maraviroc（CCR5抑制剂）和BAY-876（GLUT1抑制剂）。

**研究结果**

**1. 构建用于分选前导细胞和跟随细胞的3D多细胞光转换CRC球体模型**
通过构建3D集体侵袭模型，发现SW620和HCT15细胞在I型胶原中形成集体侵袭。荧光标记后，激光光转换前导细胞为红色，流式分选获得前导细胞和跟随细胞。前导细胞表达更高的干性标志物（CD133、OCT4、LGR5）和CD26（转移起始细胞标志物），且两者均呈现混合上皮-间质状态。

**2. 前导细胞在CRC集体侵袭中不可或缺**
体外实验显示前导细胞与跟随细胞增殖能力无差异，但前导细胞迁移和侵袭能力更强，混合培养时集体侵袭能力显著高于单独跟随细胞。体内皮下异种移植中，前导细胞形成不规则边缘的集体侵袭肿瘤，而跟随细胞形成光滑圆形边界；原位接种后前导细胞组肝转移率（40%）高于跟随细胞组（0%）。前导细胞对奥沙利铂和5-FU联合治疗具有更强的耐药性。

**3. 前导细胞富集HIF-1信号通路、糖酵解、氨基酸生物合成和代谢相关基因**
RNA-seq和KEGG富集分析表明前导细胞主要激活HIF-1信号通路、糖酵解和氨基酸生物合成代谢，而跟随细胞富集氧化磷酸化通路。验证实验证实前导细胞中糖酵解相关基因SLC2A1（GLUT1）和氨基酸代谢基因表达升高，跟随细胞中氧化磷酸化基因表达升高。使用氧化磷酸化抑制剂寡霉素处理跟随细胞后，其集体侵袭能力增强，表明代谢转换促进集体侵袭。

**4. CCL5通过PI3K/AKT信号通路诱导前导细胞中GLUT1和PLOD2表达，促进CRC集体侵袭**
从前导细胞中高表达的12个差异基因中筛选出CCL5、GLUT1和PLOD2，其敲低显著抑制前导细胞的侵袭和集体侵袭能力。在跟随细胞中过表达CCL5可增强其集体侵袭能力，并上调GLUT1和PLOD2表达；而在前导细胞中敲低CCL5则下调两者表达，且通过恢复GLUT1或PLOD2可挽救侵袭缺陷。CCR5抑制剂Maraviroc处理前导细胞后，磷酸化PI3K（p-PI3K）和磷酸化AKT（p-AKT）水平降低，GLUT1和PLOD2蛋白表达下降，表明CCL5通过PI3K/AKT通路调控GLUT1和PLOD2。

**5. CCL5⁺GLUT1⁺前导细胞能有效驱动CRC集体细胞侵袭**
从SW620细胞中分选CCL5⁺GLUT1⁺和CCL5^?GLUT1^?亚群。CCL5⁺GLUT1⁺细胞表达更高的干性标志物，呈现部分EMT（上皮-间质转化）表型，体外迁移和集体侵袭能力更强，体内皮下肿瘤显示集体侵袭边缘。Maraviroc和BAY-876单独或联合处理前导细胞，显著抑制体外侵袭和集体侵袭，以及体内皮下肿瘤的集体侵袭，联合抑制效果更佳。

**6. CRC组织中CCL5、GLUT1和PLOD2的临床病理学分析**
279例CRC患者病理切片中，162例（58%）存在集体侵袭，其预后显著更差，且与T分期、复发、临床分期、淋巴结转移、远处转移和MMR（错配修复）状态显著相关。在人类CRC组织和肝转移组织中，CCL5和GLUT1在集体侵袭前沿的肿瘤细胞中高表达，肿瘤中心低表达。皮下肿瘤中前导细胞的CCL5、GLUT1和PLOD2表达也高于跟随细胞。集体侵袭肿瘤巢周围胶原沉积增加。TCGA数据库分析显示CCL5和GLUT1高表达患者预后更差；在随访队列中，两者在侵袭前沿的共表达与不良预后强相关。

**总结与讨论**
本研究建立了光转换蛋白标记、I型胶原3D培养和流式细胞术整合的实验系统，实现了基于空间位置的前导细胞精确分离，为机制研究提供了可靠工具。在此基础上，研究人员鉴定出CCL5和GLUT1是CRC集体侵袭中前导细胞的特异性表面生物标志物，填补了该领域缺乏明确分子标志物的空白。体内实验证明抑制CCR5（Maraviroc）和GLUT1（BAY-876）可有效抑制集体侵袭，提示针对具有此种侵袭行为的CRC患者可能具有治疗前景。研究局限性包括：永生化细胞系无法完全模拟患者肿瘤异质性和微环境，免疫缺陷小鼠模型限制了对CCL5免疫调节作用的评估。但临床组织验证支持其临床相关性。未来将开发更先进的原代细胞模型和免疫活性体内系统。

**研究结论**：因此，本研究采用光转换3D CRC球体模型分离前导细胞，鉴定出CCL5和GLUT1作为特异性标志物。这些基因作为CRC集体侵袭中代谢转变和胶原沉积的关键调节因子，突显其作为治疗靶点的潜力。