成年心肌细胞肌浆网/内质网中蛋白质合成网络的发育

《The Journal of Physiology》：Development of a protein synthesis network at the sarco/endoplasmic reticulum in adult cardiac myocytes

　　

内质网（endoplasmic reticulum, ER）是膜蛋白和分泌蛋白合成与折叠的主要场所，这两类蛋白质共同构成哺乳动物细胞总蛋白质输出中的很大一部分。横纹肌细胞含有一种特化的膜系统——肌浆网（sarcoplasmic reticulum, SR），其调控钙稳态和收缩。然而，ER与SR之间的生化和生理关系，以及这两个区室对蛋白质合成的贡献程度，仍未得到完全理解。对分离的室性心肌细胞中ER/SR相关蛋白的定量分析显示，ER/SR驻留的蛋白质质量控制组分和核糖体的相对丰度在出生后成熟过程中下降，而SR相关的Ca²⁺处理蛋白则增加。免疫细胞化学显示，在出生后早期阶段显著的膜区室主要呈现ER特征，并在出生后发育过程中减少。在成年心肌细胞中，SR成为整个细胞中占主导地位的膜网络，而ER标志物仍富集于核周区域。免疫细胞化学进一步表明，ER和SR执行重叠但截然不同的特化功能，其中兴奋-收缩偶联定位于SR，分泌的起始集中于ER。在成年室性心肌细胞中，核糖体和mRNA定位于ER和SR附近，表明它们是局部蛋白质合成和稳态的直接位点。这些发现表明，心脏肌肉发育过程中ER/SR的分子分化和结构组织最终形成成年心肌细胞肌浆/内质网内的特化蛋白质合成网络。

**研究背景与目的**

内质网（endoplasmic reticulum, ER）是真核细胞中膜蛋白和分泌蛋白合成与折叠的主要场所。横纹肌细胞含有特化的膜系统——肌浆网（sarcoplasmic reticulum, SR），其主要功能是调控钙稳态和肌肉收缩。尽管SR在心肌细胞兴奋-收缩偶联（excitation–contraction coupling, EC偶联）中的作用已被充分确立，但ER与SR之间的生化和生理关系，以及这两个膜区室在蛋白质合成中的相对贡献仍不完全清楚。此前存在两种模型：一种认为蛋白质合成和分泌局限于核周ER，SR不参与蛋白质合成而仅调节钙；另一种认为蛋白质合成贯穿于包含核周ER和外周粗糙SR的连续膜网络。此外，成熟心肌细胞中是否同时存在"ER"和"SR"两种膜网络，抑或单一高度特化的"SR"膜系统同时承担ER和SR的功能，仍属未知。为此，研究人员开展了本研究。

**研究内容与结论**

研究人员利用新生（1–3天）和成年（8周）Wistar大鼠及10周龄C57BL/6J或C57BL/6N小鼠的原代室性心肌细胞，结合免疫印迹、免疫细胞化学、受激发射损耗（stimulated emission depletion, STED）超分辨显微镜、高压冷冻透射电子显微镜、嘌呤霉素脉冲标记和mRNA荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）等多种技术，系统研究了心肌细胞成熟过程中ER/SR膜网络的分布、结构组织及蛋白质合成功能。研究发现：成年心肌细胞中存在两个功能不同但相互连接的膜结构域——核周ER样网络和外周横纹状SR网络；核糖体和mRNA同时定位于ER和SR，且活性蛋白质合成发生在SR网络；核糖体与纵行SR紧密关联但与连接部SR区域空间上相互排斥。这些发现确立了肌浆/内质网作为成年心肌细胞中空间组织的蛋白质合成网络的概念。论文发表在《The Journal of Physiology》。

**主要技术方法**

研究人员分离了新生（1–3天）和成年（8周）Wistar大鼠以及10周龄C57BL/6J或C57BL/6N小鼠的室性心肌细胞，并使用RiboTag小鼠（Rpl22^tm1.1Psam/J）进行心肌细胞特异性核糖体标记。主要技术包括：免疫印迹检测蛋白相对丰度；免疫细胞化学和共聚焦显微镜分析蛋白亚细胞定位；STED超分辨显微镜解析核糖体与SR亚区的空间关系；高压冷冻透射电子显微镜观察核糖体-膜超微结构关联；嘌呤霉素脉冲标记检测新生多肽合成位点；poly(A)-mRNA FISH可视化转录本分布。

**研究结果**

**1. 心肌细胞的肌浆网和内质网形成功能不同但重叠的相互连接的膜结构域**

免疫印迹显示，新生心肌细胞中ER/SR驻留蛋白质质量控制组分（GRP78、GRP94、PDIA6）和核糖体标志物RPS6的相对丰度高于成年细胞，而成年心肌细胞中Ca²⁺处理蛋白RyR2和SERCA2的相对表达更高。免疫荧光共定位显示，新生心肌细胞中KDEL（ER驻留蛋白标志）与SERCA2在核周膜网络中共定位；成年心肌细胞则呈现两个不同但相互连接的膜结构域：核周ER样网络（SERCA与KDEL重叠）和外周横纹状SR（SERCA与RyR2重叠，KDEL信号较弱）。RyR2在成年细胞中不存在于核周ER，可作为区分ER与SR的标志物。高尔基体标志物GM130和TGN38在新生和成年心肌细胞中均紧密关联于核周ER，表明经典分泌途径主要集中于核周ER。

**2. 核糖体定位于成年心肌细胞的肌浆网和内质网**

p-RPS6（S6核糖体蛋白Ser235/236磷酸化形式）在新生心肌细胞中分布于整个细胞，核周ER处染色最强；在成年心肌细胞中则同时定位于核周ER和横纹状SR。RiboTag小鼠中HA标记的RPL22（60S核糖体亚基成分）同样定位于ER和SR，证实核糖体分布模式在不同物种和抗体间一致。poly(A)-mRNA FISH显示mRNA在成年心肌细胞中定位于核周ER样区域和外周横纹状SR网络。嘌呤霉素脉冲标记显示，新生心肌细胞中新生多肽主要集中于核周区域，而成年心肌细胞中呈现与外周SR横纹状组织一致的条纹模式，且环己酰亚胺（cycloheximide, CHX）处理可完全消除信号，表明SR在成熟心肌细胞中成为活跃翻译的主要位点。

**3. 超分辨和超微结构成像证实核糖体与心肌细胞肌浆网的关联**

透射电子显微镜显示膜结合核糖体与核