龙眼（Dimocarpus longan Lour.）种质鉴定用基于SNP的KASP DNA指纹系统的开发

《Scientia Horticulturae》：Development of a SNP-based KASP DNA fingerprinting system for longan ( Dimocarpus longan Lour.) germplasm identification

　　

准确的种质鉴定对于龙眼（Dimocarpus longan Lour.）的保护和利用至关重要，但现有的基于形态学和SSR的方法缺乏常规使用所需的通量。在本研究中，研究人员开发了首个基于SNP的竞争性等位基因特异性PCR（KASP）龙眼DNA指纹系统，并与数字身份码平台相结合。对来自中国和东南亚的野生群体、地方品种和现代栽培品种等209份龙眼种质进行了限制性位点相关DNA测序（RAD-seq），获得了161 Gb的清洁读段，并对照龙眼参考基因组鉴定了11,094,725个双等位基因SNP。逐步质量过滤和连锁不平衡过滤保留了59,658个高质量SNP，分布遍及全部15条染色体。主成分分析和ADMIXTURE分析（K = 7）揭示了该群体内部的结构化多样性。严格的侧翼区和多态性过滤产生了4,129个可转化为KASP的SNP，其中124个候选标记被合成并在包含79份代表性种质的代表性群体上进行了验证。共有24个KASP检测产生了清晰的三簇基因型分型，多态性信息含量（PIC）值为0.647–0.795。该24标记组合完全区分了所有79份种质，包括那些此前无法通过形态学描述区分的种质。多位点基因型被编码为24位数字身份码及相应的QR码，建立了一个可部署的数字指纹平台。该系统为龙眼种质保护、品种保护和标记辅助育种提供了一种可扩展、可重复且适用于田间应用的分子鉴定工具。

龙眼（Dimocarpus longan Lour.）种质资源精准鉴定是实现其有效保护与利用的关键前提，然而传统基于形态学性状和SSR标记的方法通量低、可重复性差，难以满足大规模常规鉴定需求。本研究首次开发了基于竞争性等位基因特异性PCR（KASP）技术的龙眼SNP DNA指纹系统，并将其与数字身份码平台整合。研究人员利用限制性位点相关DNA测序（RAD-seq）对来自中国和东南亚的209份龙眼种质（包括野生种群、地方品种和现代栽培品种）进行测序，共获得161 Gb清洁读段，并鉴定出11,094,725个双等位基因SNP。经逐步质量筛选和连锁不平衡修剪后，保留59,658个分布于全部15条染色体的高质量SNP。主成分分析和ADMIXTURE结构分析（最优K=7）揭示了种质群体的遗传分化格局。通过严格的侧翼序列纯度和多态性筛选，获得4,129个可转化KASP的SNP，其中124个候选位点被合成并在79份代表性种质上验证。最终24个KASP标记产生清晰的三簇基因型分型，多态性信息含量（PIC）介于0.647–0.795之间。该24标记组合能够完全区分全部79份供试种质，包括此前难以通过形态学区分的材料。每位点的多位点基因型被编码为24位数字身份码，并进一步生成条码和QR码，构建了可直接部署的数字指纹平台。该系统兼具可扩展性、可重复性和田间适用性，为龙眼种质资源保存、品种权保护和标记辅助育种提供了实用的分子鉴定工具。

**研究背景与问题**
龙眼是原产我国南方及东南亚的无患子科常绿果树，其假种皮富含可溶性糖、维生素C和具抗氧化活性的酚类物质。我国拥有世界上最丰富的龙眼种质资源，包括野生资源、地方品种和栽培品种。然而，由于缺乏准确、标准化的鉴定体系，大量种质的遗传潜力尚未被充分挖掘。传统上龙眼种质鉴定依赖形态学描述，如果实、叶片性状和物候期，但这些性状易受环境和树龄影响，常导致同物异名、异物同名及标签错误。分子标记虽不受环境干扰，但RAPD、AFLP、ISSR和SSR等标记在通量和重复性方面存在局限：SSR虽共显性、多态性高，但依赖凝胶或毛细管电泳，难以实现高通量、标准化的常规鉴定。单核苷酸多态性（SNP）是植物基因组中最丰富的变异类型，而KASP技术是一种基于荧光、共显性的SNP分型方法，兼具高准确性、低单个数据点成本和适合384/1536孔板的高通量优势。KASP指纹系统已在苹果、葡萄、甘薯、茄子等作物中建立，但龙眼因缺乏染色体级参考基因组而无法开展此类工作。近期龙眼染色体级参考基因组的发布使这一目标成为可能，但此前尚无龙眼KASP指纹系统的报道。此外，将多位点SNP基因型编码为机器可读的条码或QR码可实现数字化种质管理，但龙眼尚无此类数字基础设施。因此，本研究旨在利用全基因组SNP开发首个龙眼KASP DNA指纹系统，并整合数字身份码平台，以解决传统鉴定方法的通量和标准化瓶颈。

**主要技术方法**
研究人员采用以下关键技术流程：（1）对209份龙眼种质（涵盖中国福建、广东、广西、海南、云南、四川及东南亚泰国、越南的野生资源、地方品种和现代栽培品种，主要来源于国家热带果树种质资源圃等）进行RAD-seq测序，获得基因组SNP；（2）利用GATK进行变异检测，并通过质量指标、次要等位基因频率（MAF）、缺失率和连锁不平衡（LD）逐步过滤，获得高质量SNP集；（3）使用PLINK2进行LD修剪，利用EIGENSOFT和ADMIXTURE进行主成分分析和群体结构推断；（4）基于侧翼序列纯度、MAF和染色体分布等标准设计KASP引物，在79份代表性种质上验证，筛选出可产生清晰三簇分型的标记；（5）计算多态性信息含量（PIC）等统计量，评估标记鉴别力；（6）将多位点基因型编码为24位数字身份码，并生成Code 128条码和QR码。

**研究结果**
**3.1 龙眼种质全基因组SNP发掘**
对209份龙眼种质进行RAD-seq，共获得167 Gb原始读段和161 Gb清洁读段（平均每份772 Mb，有效率96.67%，平均Q30为91.16%）。清洁读段与参考基因组的平均比对率为90.19%，覆盖度为68.08%。变异检测共鉴定出11,094,725个双等位基因SNP。经质量、MAF、缺失率和LD逐步过滤后，保留59,658个染色体锚定的无连锁SNP，平均密度约133 SNPs/Mb，均匀分布于15条染色体（每条染色体SNP数2222至6982）。

**3.2 SNP的基因组分布与功能注释**
功能注释显示，大多数SNP位于非编码区：40.93%为基因间区，22.73%位于基因上游5 kb，23.99%位于下游5 kb，6.95%位于内含子，5.17%位于外显子。外显子SNP中，59.47%为错义突变，38.55%为同义突变，1.98%为无义或移码突变；错义/同义比（1.54）表明编码区存在丰富多样性。基因型频率分析显示，平均49.23%为纯合参考型、21.67%为杂合型、11.72%为纯合变异型；排除缺失数据后，平均观察杂合度（H?）为0.26，符合龙眼异交繁殖特性。转换/颠换（Ts/Tv）比值平均为2.76，表明SNP调用准确性较高。

**3.3 遗传多样性与群体结构**
基于59,658个SNP的主成分分析显示，前两个主成分分别解释22.53%和15.55%的方差。种质大致按地理来源聚类，但存在重叠，反映历史种质交流；东南亚种质和野生种质与其余样品明显分离。ADMIXTURE分析确定最优K=7（交叉验证误差最小）。在K=7时，Cluster 2最大（n=51），包含海南、广东全部野生种质、云南6份中的4份野生种质以及部分越南和泰国种质，野生种质共享同一祖先组分而非形成省份特异簇；Cluster 1（n=24）最均一，主要由四川种质组成；Cluster 5（n=19）以“丰大”育种系列为主；其余簇分别以福建、广西、广东栽培种质为主。比较K=2–7的结果确认了结构的稳定性：野生和东南亚种质在K=2时即与栽培群体分离，四川群体在K=4时成为独立簇，福建、广东和广西品种亚群在K=5–7逐步出现。209份种质中有90份（43%）显示跨两个或多个簇的混合成员关系，表明存在广泛的共享祖先和人为介导的种质交流；混合程度在Cluster 7中最明显。若干形态学上差异明显的种质具有近乎相同的SNP谱，表明无性繁殖下同一克隆材料在不同地区被保留并重新命名。

**3.4 KASP标记的开发与验证**
对59,658个SNP逐步过滤：19,765个SNP无侧翼变异，16,628个满足多态性阈值，最终4,129个成功设计KASP引物。从中选择124个引物组合在79份种质上验证。124个检测中，114个（91.9%）成功扩增目标位点，但只有24个产生无歧义的三簇基因型分型（缺失率<10%且与阴性对照清晰分离），实际标记转化率仅为19.4%（24/124）。其余90个扩增成功的检测因簇压缩或偏离轴而被弃用。保留的24个标记分布于15条染色体中的12条，每条染色体不超过4个标记，技术重复间基因型分型完全一致。在79份种质中，24个标记的PIC值范围为0.647–0.795，平均0.717，均高于高信息量阈值0.5。Ho和He值与PIC分布一致。两两多位点比较显示，所有种质对在至少2个标记位点上不同，主要差异模式为14–17个位点（不相关种质），次要模式为2–4个位点（密切相关的品种和杂交后代）。没有两份种质共享相同的多位点基因型，表明24标记组合能为每份种质提供唯一分子身份。特别是形态学难以区分的福建Cluster 3地方品种和“凤梨朵”ד大乌圆”后代被清晰区分。

**3.5 数字DNA指纹与QR码编码**
每份种质的24标记基因型被编码为唯一的24位数字身份码。多位点基因型热图明确区分了全部79份种质，无共享码。每个码进一步转换为Code 128一维条码和QR二维码，可打印在植物标签或运输标签上，用标准移动设备扫描即可检索相关元数据。对选定种质进行独立DNA提取和不同反应板的重复基因型分型，返回完全相同的身份码，证实了流程的可重复性。

**讨论与结论**
本研究建立了首个龙眼SNP-based KASP DNA指纹系统，利用209份种质的全基因组变异，获得59,658个高质量SNP，其中24个标记组成的组合可完全区分79份多样性种质。该SNP资源显著扩大了龙眼可用的标记数量，优于此前仅基于60个转录组SNP或50份泰国种质的研究。群体结构分析揭示了野生种质与东南亚种质共享同一祖先基因库，且与多数栽培种质不同；43%的种质显示混合祖先，反映南方各省及东南亚之间的历史基因流。无性繁殖特性使同一无性系在不同地区以不同名称流传，而本研究的标记组合仍能实现完全区分。KASP标记转化率方面，虽然91.9%的检测成功扩增，但仅19.4%产生清晰三簇，失败原因包括基因型簇缺失、簇分离差、等位基因扩增偏倚和非特异性扩增；其中等位基因偏倚和非特异扩增可通过重新优化解决，而低频或旁系同源SNP应在设计前预筛。24个标记平均PIC为0.717，超过龙眼SSR指纹面板报道值，且完整区分所有测试种质。该系统整合24位数字身份码和QR码，为种质管理提供了现场可部署的数字工具。研究局限性包括RAD-seq仅覆盖部分基因组、群体未包含龙眼近缘亚种、以及当前标记面板在扩展到国家种质圃数百份种质时可能需要补充标记。结论：研究人员开发了首个龙眼KASP DNA指纹鉴定系统，24个标记完全区分79份代表性种质，并整合为数字身份码和QR码平台，为龙眼种质保护、品种保护和标记辅助育种提供了可扩展、可重复、可现场应用的分子工具，也为未来全基因组关联研究和性状连锁标记开发奠定了基础。