用于检测牛奶中乳腺炎相关细菌的DNA提取方法的比较评估

《The Veterinary Journal》：Comparative evaluation of DNA extraction methods for detecting mastitis associated bacteria in milk

　　

摘要翻译
牛乳是一种复杂的生物液体，富含蛋白质和脂肪，可抑制酶促扩增，给细菌DNA提取带来挑战。尽管已有商业化提取试剂盒，但其成本较高且依赖设备。本研究旨在评估一种适用于实验室条件下牛乳的快速、经济且无需离心的DNA提取方法。研究人员将优化的HotSHOT（HS）方案与五种商业离心柱试剂盒及一种煮沸方法进行比较，使用金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）和多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida, P. multocida）分别作为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌代表，添加至巴氏杀菌乳中。确定了每种提取方法的检测限（limit of detection, LOD）。所有方法提取的DNA均采用比色环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）和聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）进行检测。HS方法在LAMP检测中对P. multocida的LOD为1.58 × 10³菌落形成单位（colony-forming units, CFU）/mL，对S. aureus为8.4 × 10⁴ CFU/mL；在PCR检测中分别为1.58 × 10⁵和8.4 × 10⁵ CFU/mL。这些终点在实验室条件下处于若干商业试剂盒所观察到的范围内。由于本研究未包含独立的加标牛奶和DNA提取重复，结果不证明各提取方法之间存在统计学等效性或优越性。需要利用独立制备的样本和患有乳腺内感染的奶牛乳汁进行进一步评估。

论文解读文章

**研究背景与目的**

牛乳作为诊断样本，其高脂肪、高蛋白和高钙含量会抑制酶促扩增反应，给细菌DNA提取带来显著困难。传统的DNA提取多依赖商业试剂盒，这些试剂盒往往成本高昂、操作繁琐且依赖离心机等实验室设备，限制了其在资源有限环境或现场诊断中的应用。奶牛乳腺炎（bovine mastitis）是一种传播迅速的感染性疾病，及时检测对控制群体暴发和经济损失至关重要。因此，开发一种简单、快速、低成本且无需离心的DNA提取方法具有重要实际意义。HotSHOT（HS）法最初由Rudbeck和Dissing（1998）开发，是一种基于高pH裂解和Tris-HCl中和的低成本、无需离心的提取方法，但尚未应用于牛奶样本。本研究旨在评估一种改良的HS方案在实验室条件下从牛奶中提取细菌DNA的性能，为其未来现场应用提供基础。

**研究设计与技术方法**

研究人员选用金黄色葡萄球菌（S. aureus）作为革兰氏阳性代表菌（临床分离株，来自Charles Sturt大学兽医诊断实验室），以及多杀性巴氏杆菌（P. multocida）减毒株（来自Vaxsafe? PM疫苗，Bioproperties Pty Ltd., Australia）作为革兰氏阴性代表菌，分别掺入巴氏杀菌全脂牛奶（pH 6.54，脂肪4.0%）中，制备系列稀释样本。采用七种提取方法进行比较：优化的HS法、煮沸法，以及五种商业离心柱试剂盒（Wizard? Genomic DNA Purification Kit、ReliaPrep? Blood gDNA Miniprep System、QIAamp DNA Microbiome Kit、Milk Bacterial DNA Isolation Kit、Quick-DNA Fecal/Soil Microbe Miniprep Kit）。提取的DNA分别通过比色LAMP和PCR进行扩增检测，靶基因为S. aureus的nuc基因和P. multocida的kmt1基因。LOD定义为三个技术重复中至少两个阳性的最低细菌浓度。样本队列为实验室制备的加标巴氏杀菌奶，未包含临床乳腺炎牛奶样本。

**研究结果**

**HS DNA提取方法的优化与稳定性**

HS法使用两种简单缓冲液：裂解缓冲液（25 mM氢氧化钠和0.2 mM EDTA二钠，pH 12.0）和中和缓冲液（40 mM Tris-HCl，pH 1.9）。裂解缓冲液在混合时达到目标pH，室温下稳定至少三个月；中和缓冲液（从初始pH 4.7调整至1.9）至少稳定五个月。提取的DNA在4°C下储存两个月后仍适用于LAMP和PCR扩增。通过LAMP检测发现，加标牛奶在90°C孵育10分钟即可实现有效提取，延长至15–35分钟未提高灵敏度，因此确定10分钟为最佳加热时间。

**DNA提取方法的比较概览**

七种方法中，HS法成本最低（< AU$ 0.50/样本），处理时间仅10–15分钟，所需设备仅加热块或水浴。商业试剂盒处理时间为20–60分钟，成本为AU$ 6–24/样本，且需离心步骤。煮沸法虽简单但LOD值最高。

**金黄色葡萄球菌的检测限**

LAMP检测中，HS法对S. aureus的观察LOD为8.4 × 10⁴ CFU/mL，而商业试剂盒的LOD范围为8.4 × 10¹至8.4 × 10⁵ CFU/mL，煮沸法为8.4 × 10⁸ CFU/mL。PCR检测中，HS的LOD为8.4 × 10⁵ CFU/mL，商业试剂盒为8.4 × 10⁰至8.4 × 10⁴ CFU/mL，煮沸法为8.4 × 10⁸ CFU/mL。

**多杀性巴氏杆菌的检测限**

LAMP检测中，HS法对P. multocida的LOD为1.58 × 10³ CFU/mL，与ReliaPrep、Zymo和Norgen试剂盒相同，优于QIAamp和Wizard（1.58 × 10⁴ CFU/mL）及煮沸法（1.58 × 10⁷ CFU/mL）。PCR检测中，HS的LOD为1.58 × 10⁵ CFU/mL，而商业试剂盒为1.58 × 10¹至1.58 × 10³ CFU/mL，煮沸法为1.58 × 10⁶ CFU/mL。

**检测限的汇总比较**

总体而言，HS法在两种细菌和两种扩增方法中获得的LOD均落在商业试剂盒观察范围内。但不同提取方法的相对排序随细菌种类和检测方法而变化，这些结果为描述性分析终点，未进行推断性统计比较。

**讨论总结与结论**

讨论指出，HS法的性能受细菌细胞壁结构、靶基因拷贝数、残留乳汁抑制剂及引物特性等多因素影响。与煮沸法相比，HS法显著降低了LOD，且不需离心和专用试剂，具有操作简便、成本低、时间短等优势。然而，HS法产生的粗裂解物可能含有残留脂肪、蛋白质和钙离子，可能抑制扩增；此外，pH敏感性可能影响比色LAMP的颜色判读。研究局限性在于未包含独立加标和提取重复，无法证明统计学等效性或优越性。结论部分翻译如下：本研究证明，优化的HS DNA提取方法在实验室条件下使用加标巴氏杀菌奶样本时，获得的观察检测限处于几种商业试剂盒的范围内。由于LOD评估基于同一DNA提取物的技术扩增重复，这些发现不证明各提取方法之间的统计学等效性或优越性。该方法在简单性、成本和操作时间方面具有优势，支持其作为牛奶样本简化DNA提取方法的潜力。虽然这些结果为简化提取流程奠定了基础，但在考虑临床、现场或农场应用之前，仍需利用患有乳腺内感染的奶牛乳汁进行进一步验证。该论文发表于《The Veterinary Journal》。