丹麦欧洲刺猬（*Erinaceus europaeus*）在COVID-19大流行前后的冠状病毒流行情况

《Veterinary Microbiology》：Coronavirus in European hedgehogs ( Erinaceus europaeus) from Denmark before and during the COVID-19 pandemic

　　

本研究对COVID-19大流行前后丹麦欧洲刺猬（*Erinaceus europaeus*）中冠状病毒的流行率和遗传多样性进行了全面评估。研究人员使用泛冠状病毒逆转录-聚合酶链反应（pan-coronavirus RT-PCR）检测并结合序列分析，在430份粪便样本中检测到98份（23%）冠状病毒核糖核酸（RNA）。所有阳性序列均被鉴定为*Betacoronavirus erinacei*。在2016年样本中，流行率为16%（31/199），而在2021-2022年样本中为29%（67/231）。通过SARS-CoV-2特异性实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（real-time RT-PCR）检测，所有样本均呈阴性，表明欧洲刺猬中未检测到SARS-CoV-2循环。对RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）基因片段的分析揭示了55个单倍型，但核苷酸差异较低，表明遗传稳定性高。对刺突蛋白受体结合域（RBD）的分子分析显示，丹麦分离株仅含有人二肽基肽酶4（hDPP4）受体结合所需的12个关键氨基酸残基中的1个，表明其与中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）的结合能力有限，人畜共患潜力较低。系统发育分析确定所有序列均属于*Betacoronavirus erinacei*分支，与厄氏刺猬冠状病毒HKU31（Ea-HedCoV HKU31）亲缘关系最近。数据探索分析显示，采样年份与冠状病毒阳性率显著相关，2022年样本的阳性风险比2016年高约3.7倍，但研究人员指出这可能反映队列效应而非真实的时间增加。在2016年子集中，除草剂暴露与较高的冠状病毒阳性率呈显著相关，但其他变量（如年龄、性别、城市/农村栖息地、遗传多样性、杀虫剂暴露）未发现显著关联。本研究未发现SARS-CoV-2在刺猬中传播的证据，且基于RBD序列分析，*Betacoronavirus erinacei*的人畜共患潜力似乎较低。这些发现支持欧洲刺猬不太可能成为具有重大人畜共患潜力的冠状病毒的重要储存宿主。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
COVID-19大流行突显了动物源性感染（即从动物传播给人类并在人群中传播的传染病）的重要性。城市化加剧和集约化农业使野生动物与人类接触更紧密，增加了病原体溢出（spillover）的机会。公众对人畜共患风险的担忧有时会负面影响野生动物保护，例如欧洲刺猬（*Erinaceus europaeus*），该物种在其原生分布区的大部分地区数量正在下降。自德国首次报道刺猬冠状病毒（Corman et al., 2014）以来，多项研究已报告在欧洲刺猬中检测到*Betacoronavirus erinacei*（此前称为刺猬冠状病毒1型，He-CoV-1；或厄氏刺猬冠状病毒，EriCoV），流行率从英国约10.8%到德国近60%不等。该病毒属于β冠状病毒属（*Betacoronavirus*）中与MERS相关的谱系。2021年一项基于机器学习预测的研究提出，欧洲刺猬可能携带能够感染人类的重组冠状病毒，但该算法未考虑生态约束。媒体随后将刺猬描绘为潜在疾病威胁，引发公众担忧。然而，后续分析表明刺猬不太可能成为SARS-CoV-2的储存宿主，且分子研究显示欧洲刺猬的血管紧张素转换酶2（ACE2）受体缺乏SARS相关冠状病毒刺突蛋白有效结合所需的多个氨基酸。因此，本研究旨在表征2016年和2021-2022年采样的丹麦刺猬中冠状病毒的流行率和遗传多样性，并调查其潜在人畜共患风险相关的分子特征。论文发表在《*Veterinary Microbiology*》。

**主要技术方法**
研究人员采集了丹麦430份欧洲刺猬粪便样本，分别来自2016年死亡个体（队列1，n=199，通过公民科学收集）和2021-2022年野生动物康复中心收治个体（队列2，n=231）。使用泛冠状病毒RT-半巢式PCR扩增约430 bp的RdRp基因片段，并进行Sanger测序。所有样本还使用SARS-CoV-2特异性一步法实时RT-PCR（Allplex? SARS-CoV-2 Assay）检测E、RdRp/S和N基因。针对*Betacoronavirus erinacei*阳性样本，设计特异性引物扩增刺突蛋白RBD片段。使用最大似然法（Tamura 3参数模型）构建系统发育树，并通过中位连接网络分析单倍型关系。运用Firth惩罚逻辑回归和单变量逻辑回归分析冠状病毒阳性率与性别、年龄、栖息地类型（城市/农村，基于CORINE土地覆盖数据）、采样年份、区域、样本背景、遗传杂合度、农药暴露等因素的关联。

**研究结果**
**3.1. 冠状病毒检测**：在430份样本中，98份（23%）为泛冠状病毒PCR阳性，2016年流行率16%（31/199），2021-2022年为29%（67/231）。所有阳性产物均成功测序。所有样本的SARS-CoV-2特异性实时RT-PCR检测均为阴性，表明在研究的刺猬中未检测到SARS-CoV-2 RNA。

**3.2. 序列类型（单倍型）定义与分析**：基于100%核苷酸同一性，98条部分RdRp序列定义了55个不同的单倍型（Betacoronavirus1至55）。主导单倍型H1包含30个分离株（30.6%），其余单倍型多样性高但核苷酸差异低，多数仅相差1-2个核苷酸替换。BLASTn分析显示，丹麦*Betacoronavirus erinacei*分离株与欧洲其他国家（尤其是德国）的变异株共享96.15%至98.21%的遗传相似性。RdRp片段中57个可变密码子中，70.2%为同义替换，表明该基因受强功能约束和纯化选择。中位连接网络呈现明显的星状拓扑，主导单倍型位于中心，显示有限的序列分化。

**3.3. 刺突蛋白受体结合域结构分析**：从27个代表性样本成功扩增并测序了刺突RBD片段。氨基酸比对显示，丹麦*Betacoronavirus erinacei*变异株仅含有与MERS-CoV受体hDPP4结合所需的12个关键氨基酸残基中的1个，但与厄氏刺猬冠状病毒HKU31（Ea-HedCoV HKU31）保守6个位点。这表明与人受体结合能力有限。

**3.4. 系统发育分析**：55个丹麦序列类型均与*Betacoronavirus erinacei*聚类，形成单系群，与未分类的merbecovirus厄氏刺猬冠状病毒HKU31亲缘关系最近。丹麦序列类型未按采样时期（COVID-19大流行前vs.期间）聚类，表明该基因组区域无时间结构。

**3.5. 数据分析**：
**3.5.1. 全数据集探索性分析**：Firth惩罚逻辑回归显示，采样年份与冠状病毒阳性率显著相关，2022年样本阳性风险是2016年的3.70倍（95% CI 1.43–10.76，p=0.006）。性别、年龄、样本背景、区域、城市/农村状态均无显著关联。
**3.6. 2016年数据集探索性分析**：单变量逻辑回归分析中，年龄、性别、MRSA携带状态、内寄生虫感染、遗传杂合度（iHO）、城市/农村栖息地、农药暴露总体均无显著效应。但除草剂暴露与冠状病毒阳性率呈显著正相关（OR=5.23，95% CI 1.18–37.20，p=0.049），杀虫剂暴露呈正趋势但未达显著（p=0.071），杀鼠剂无关联。由于阳性样本数有限，这些结果应视为探索性。

**讨论与结论**
本研究提供了丹麦欧洲刺猬中冠状病毒流行率和遗传多样性的全面评估。仅检测到*Betacoronavirus erinacei*，且该病毒在刺猬中流行率较高（23%），但RdRp片段显示有限的核苷酸变异，主要由近期点突变驱动，无高度分化的谱系。系统发育分析确认其属于merbecovirus谱系，与厄氏刺猬冠状病毒HKU31关系最近。未发现SARS-CoV-2循环，与之前基于ACE2受体不兼容的预测一致。刺突RBD分析显示其与人hDPP4结合的关键残基高度不保守，提示人畜共患潜力低。然而，近期研究（Jin et al., 2025）发现刺猬merbecovirus使用氨基肽酶N（APN）作为细胞受体，而非DPP4，因此RBD序列分析需谨慎解读。研究结论：欧洲刺猬不太可能成为具有重大人畜共患潜力的冠状病毒的重要储存宿主，但需警惕公众将刺猬视为疾病威胁而影响其保护。未来需要基于完整病毒基因组的功能研究来明确宿主范围和人畜共患风险。