从商业发酵干鲣鱼中分离的曲霉属真菌的病毒群落

《Virology》：Viral community in Aspergillus spp. isolated from commercially available fermented dried bonito

　　

鲣节（Katsuobushi）是一种用于日式烹饪的传统加工海产品，当其通过真菌发酵生产时，称为熟干鲣鱼（karebushi）。参与鲣节发酵的真菌统称为鲣节霉菌（katsuobushi molds）。研究人员先前从鲣节霉菌中发现了七种新型病毒并确定了其基因组序列。然而，先前的研究仅使用了来自保藏中心的九株真菌菌株，使得感染鲣节发酵相关真菌的病毒多样性尚不清楚。因此，本研究旨在从商业熟干鲣鱼中分离真菌，并阐明分离株中病毒的流行情况。获得了三家制造商生产的熟干鲣鱼，并从每家制造商中分离出30株真菌菌株（包括曲霉属Aspergillus spp.）。从分离株的菌丝体制备双链RNA（dsRNA）组分。电泳结果表明，相对较高比例的分离株含有与RNA病毒感染一致的dsRNA元件（每制造商30–70%；总体59%）。此外，双链RNA测序在阿谢瓦曲霉（Aspergillus chevalieri）和蒙得维的亚曲霉（Aspergillus montevidensis）分离株中鉴定出四种新型病毒：一种beny-like病毒、一种gammapartitivirus、一种narnavirus和一种victorivirus，此外还有两种先前报道的病毒。值得注意的是，这是首次在曲霉属中报道beny-like病毒。本研究为感染鲣节发酵真菌的病毒多样性提供了见解。

**论文解读：鲣节发酵过程中曲霉属真菌的病毒群落多样性**

**研究背景与问题**
鲣节（Katsuobushi）是日式料理中用于制作高汤（dashi）的传统加工海产品，经过真菌发酵后称为熟干鲣鱼（karebushi）。参与发酵的真菌统称为鲣节霉菌（katsuobushi molds），其中曲霉属（Aspergillus spp.）在发酵过程中占主导地位。真菌病毒（mycovirus）可影响宿主的生长、孢子形成、次级代谢等生理功能，可能对鲣节霉菌的有益作用（如酶分泌和风味形成）产生潜在影响。此前，研究人员仅从保藏中心的9株真菌菌株中发现了7种新型病毒，但菌株来源有限，无法全面反映感染鲣节发酵真菌的病毒多样性。因此，本研究旨在从商业熟干鲣鱼中分离更多真菌菌株，开展大规模病毒筛查，以揭示病毒在鲣节霉菌中的流行情况和多样性。该研究发表在《Virology》。

**研究内容与结论**
研究人员从三家制造商（A、B、C）的熟干鲣鱼表面分别分离30株真菌，共获得90株分离株。通过双链RNA（dsRNA）电泳检测，发现59%（53/90）的分离株含有dsRNA条带，表明存在RNA病毒感染（各制造商感染率为30%–73%）。进一步利用片段化与引物连接的双链RNA测序（FLDS）技术，结合逆转录PCR（RT-PCR）和Sanger测序，在阿谢瓦曲霉（A. chevalieri）和蒙得维的亚曲霉（A. montevidensis）中鉴定出4种新型病毒：曲霉属Aspergillus beny-like病毒1（ASABLV1）、曲霉属Aspergillus partitivirus 1（ASAPV1）、阿谢瓦曲霉victorivirus 2（AchVV2）和蒙得维的亚曲霉narnavirus 1（AmoNV1），以及2种已知病毒（阿谢瓦曲霉chrysovirus 1和fusarivirus 1）。其中，ASABLV1是首次在曲霉属中发现的beny-like病毒，AmoNV1是首次在蒙得维的亚曲霉中报道的病毒。系统发育分析表明，ASAPV1属于Gammapartitivirus属新种，AchVV2属于Victorivirus属新种。这些发现提示鲣节霉菌普遍感染RNA病毒，且病毒多样性较高。

**关键技术与方法**
1. **真菌分离与鉴定**：从制造商A、B、C的熟干鲣鱼表面取样，涂布于含抗生素的蔗糖最低琼脂培养基（MMS20A），分离90株真菌。通过全基因组测序（Illumina NovaSeq X Plus平台），基于β-微管蛋白（benA）、钙调蛋白（CaM）和RNA聚合酶II亚基（RPB2）基因进行系统发育分析，鉴定物种。
2. **dsRNA检测与测序**：提取菌丝体总RNA，纯化dsRNA组分，进行琼脂糖凝胶电泳初步筛查；采用FLDS方法对dsRNA进行测序，并通过RT-PCR结合Sanger测序填补缺口和完善序列。
3. **病毒系统发育分析**：基于病毒RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP）氨基酸序列，使用MAFFT比对、ModelFinder选择模型，以IQ-TREE构建最大似然树，确定病毒分类地位。

**研究结果**

**从熟干鲣鱼中分离真菌及物种鉴定**
通过表型分类和分子鉴定，来自制造商A、B、C的分离株分别被分为4种、2种和3种表型类型。代表菌株的系统发育分析显示，A3、A9、A11、A26、B7、B8为阿谢瓦曲霉（A. chevalieri），C1、C8为蒙得维的亚曲霉（A. montevidensis），C26为假灰绿曲霉（A. pseudoglaucus）。

**从真菌分离株中检测dsRNA**
通过dsRNA电泳，发现制造商A、B、C的分离株中分别有70%、33%和73%呈现dsRNA条带，总体感染率为59%，表明大部分分离株携带RNA病毒。

**真菌病毒的鉴定**
对A. chevalieri A3、A11、A26和A. montevidensis C1的dsRNA进行FLDS测序，鉴定出4种新病毒：ASABLV1（beny-like病毒）、ASAPV1（gammapartitivirus）、AchVV2（victorivirus）和AmoNV1（narnavirus），以及已知病毒AchCV1和AchFV1。RT-PCR验证了各病毒的感染。

**beny-like病毒的特征**
ASABLV1的3个分离株ANPC11、ANPC12、ANPC13基因组序列相似性>99%，均为单链正义RNA（+ssRNA），编码含病毒解旋酶1结构域和Benyviridae RdRP结构域的RdRP。BlastP显示其与Entomophthora benyvirus E（EbVE）相似度最高（37%）。系统发育分析表明ASABLV1与Parabenyviridae和Mycobenyviridae相关。

**narnavirus的特征**
AmoNV1（ANPC16）基因组为2,314 nt的+ssRNA，编码RdRP，与Rhizoctonia solani narnavirus 13（RsNV13）相似度最高（33%），系统发育树显示其属于Narnavirus属。

**partitiviruses的特征**
ASAPV1的两个分离株ANPC17（来自A. chevalieri A11）和ANPC18（来自A. montevidensis C1）各有4个基因组片段，分别编码RdRP、衣壳蛋白（CP）和两个假设蛋白（ORF3、ORF4）。dsRNA3和dsRNA4与dsRNA1、2的序列相似性较低，提示可能为卫星RNA。RdRP间相似性96%，CP间相似性96%，系统发育分析显示其属于Gammapartitivirus属亚组III，符合新种标准。

**victoriviruses的特征**
AchVV2的两个分离株ANPC19和ANPC20基因组序列相似性99%，为单个dsRNA（5,321 bp），编码CP和RdRP，开放阅读框重叠8个碱基。BlastP显示RdRP与Botryosphaeria dothidea victorivirus 2（BdVV2）相似度最高（55%），系统发育树显示其属于Pseudototiviridae科Victorivirus属，可定为新种。

**已知病毒的特征**
AchCV1（ANPC14）由3个dsRNA片段组成，与先前报道的AchCV1分离株高度相似（RdRP相似性96%）。AchFV1（ANPC15）为单链+ssRNA（6,423 bp），与已知AchFV1分离株相似性99%，但未发现其第二片段，提示可能存在单片段和双片段两种变体。

**总结与讨论**
本研究从三家制造商的熟干鲣鱼中分离出90株真菌，初步鉴定出三种曲霉物种。电泳检测显示至少59%的分离株感染RNA病毒，表明鲣节发酵真菌中病毒普遍存在。通过FLDS测序，在阿谢瓦曲霉和蒙得维的亚曲霉中发现4种新型病毒，其中ASABLV1是首次在曲霉属中发现的beny-like病毒，ASAPV1和AchVV2分别为Gammapartitivirus和Victorivirus新种，AmoNV1是首次在蒙得维的亚曲霉中报道的病毒。这些发现丰富了鲣节霉菌的病毒多样性认知，提示不同制造商和环境因素可能导致病毒群落差异。未来需进一步研究病毒对宿主生理功能及鲣节品质的影响。

**研究结论翻译**
本研究从三家制造商生产的发酵干鲣鱼中分离出共90株真菌菌株。对真菌分离株dsRNA组分的电泳结果表明，至少59%的分离株感染了RNA病毒，说明参与鲣节发酵的真菌感染RNA病毒的流行率相对较高。此外，在阿谢瓦曲霉和蒙得维的亚曲霉中检测到共4种新型病毒。ASABLV1是首次在曲霉属真菌中发现的beny-like病毒，这也是首次在蒙得维的亚曲霉中报道真菌病毒的研究。因此，本研究为发酵干鲣鱼相关真菌中RNA病毒的多样性提供了见解。