mRNA–LNP递送的狂犬病病毒糖蛋白–HSV2 ICP35融合抗原的表达及其免疫原性

《Virus Research》：Expression and Immunogenicity of a Rabies Virus Glycoprotein–HSV-2 ICP35 Fusion Antigen Delivered by an mRNA–LNP Formulation

　　

研究人员利用mRNA–脂质纳米颗粒（LNP）系统构建并表达了一种狂犬病病毒糖蛋白–HSV₂ ICP35融合抗原。m⁷G–G–ICP35–PolyA转录本支持体外抗原表达。基于DC-Chol的阳离子LNP制剂促进了mRNA向哺乳动物细胞的递送。该mRNA–LNP制剂在小鼠中诱导了抗原特异性抗体和T细胞应答。mRNA–蛋白联合免疫产生的免疫应答高于单独任一方式。

近年来，mRNA疫苗作为一种能在体内表达抗原的核酸递送平台受到广泛关注，其设计策略成为当代疫苗研究的重点。单纯疱疹病毒2型（HSV₂）是生殖器疱疹的主要病原体，其UL26.5基因编码的感染细胞多肽35（ICP35）作为核衣壳支架蛋白，仅在病毒复制期间表达，且前期研究显示该蛋白具有高胞内表达水平和强免疫原性。狂犬病病毒（RABV）为负链RNA病毒，每年导致全球约5.9万人死亡，其糖蛋白G是诱导中和抗体的主要抗原，也是当前狂犬病mRNA疫苗设计中最常见的靶标。然而，现有mRNA狂犬病疫苗免疫原性有限，迫切需要改进疫苗设计策略。mRNA疫苗的表达效率受靶基因优化、非翻译区（UTR）选择、递送载体类型及表面修饰、佐剂等多种因素影响。ICP35的高表达效率和免疫原性提示其可作为支架蛋白增强目标抗原的呈递。基于此，本研究利用ICP35的免疫学特性，将编码ICP35的UL26.5基因与狂犬病病毒糖蛋白G编码序列融合，构建mRNA表达质粒，并采用一种基于DC-Chol的阳离子脂质纳米颗粒（LNP）递送系统，系统评估该融合抗原在体外和体内的表达及免疫原性。

研究人员通过PCR和重叠延伸PCR扩增RABV G基因、HSV₂ UL26.5基因及增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因，利用铰链序列连接G和ICP35，构建pVAX1–G-ICP35和pVAX1–EGFP质粒。质粒经XbaI线性化后，采用HiScribe T7 ARCA mRNA合成试剂盒体外转录，引入N1-甲基假尿苷修饰，并完成5′加帽和3′加poly(A)尾，形成m⁷G–G-ICP35–PolyA转录本，该结构省略了常规的5′UTR和3′UTR。递送系统采用薄膜分散法制备DC-Chol阳离子脂质体，加入DOPE、DSPE-PEG2000-Mannose、Span85和海藻糖，得到粒径约107–112.3 nm、zeta电位约+35 mV的LNP。体外实验表明，该制剂能有效转染293T细胞，Western blot和免疫荧光证实G和ICP35蛋白共表达。动物实验中，4周龄雌性BALB/c小鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司）被随机分为亚单位疫苗组、mRNA疫苗组、mRNA+亚单位联合组和PBS对照组，分别于第0、7、14天肌肉注射免疫。ELISA检测显示，所有免疫组均产生抗RABV IgG抗体，其中联合组抗体滴度最高达694.5 IU/mL；ELISPOT和流式细胞术检测显示，联合组诱导了更强的IFN-γ和IL-4分泌型T细胞应答及CD4⁺ T细胞活化。这些结果表明，G-ICP35融合抗原的mRNA–LNP制剂具有免疫原性，且与亚单位疫苗联合使用可增强免疫应答。该研究证明了无UTR的mRNA构建体在特定递送系统下仍可诱导免疫应答，为mRNA疫苗设计提供了新思路。论文发表于《Virus Research》。

主要关键技术方法包括：①基因构建：采用PCR和重叠延伸PCR扩增RABV G基因、HSV₂ UL26.5基因及EGFP基因，通过铰链序列连接G和ICP35，构建pVAX1–G-ICP35和pVAX1–EGFP质粒；②mRNA合成：使用HiScribe T7 ARCA mRNA试剂盒体外转录，引入N1-甲基假尿苷修饰，加帽加尾；③LNP制备与表征：薄膜分散法制备DC-Chol阳离子脂质体，加入DOPE、DSPE-PEG2000-Mannose、Span85和海藻糖，通过动态光散射、透射电镜、凝胶阻滞、CCK-8等评价粒径、电位、包封和毒性；④细胞实验：转染293T细胞，Western blot和免疫荧光检测表达；⑤动物实验：4周龄雌性BALB/c小鼠随机分4组，肌肉注射3次，ELISA检测IgG，ELISPOT检测IFN-γ/IL-4，流式细胞术分析T细胞亚群。重组G和N蛋白购自Sino Biological。

3.1 LNP配方的优化与表征：通过调整脂质比例和溶剂条件，发现最佳配比为DC-Chol:DOPE:DSPE-PEG2000-Mannose:Span85=4.5:1.5:0.13:6×10^-8，粒径约107–112.3 nm，转染效率最高。

3.2 LNP的表征：透射电镜显示脂质体均一、呈中空近球形；动态光散射测得粒径108.8±1.6 nm，PDI 0.078±0.01，zeta电位+36.3±2.5 mV，长期稳定性良好；mRNA包封后粒径增至186.7±70 nm，zeta电位降至+6.28±3.04 mV；凝胶阻滞显示N/P≥8:1时mRNA完全滞留；残留乙醇含量为9.82±0.88 ng/μL，低于中国药典限值；CCK-8实验显示浓度低于270 nmol/10⁴细胞时细胞存活率>80%。

3.3 负载EGFP mRNA的LNP在体内外均具有高转染效率：流式细胞术显示N/P=16:1时转染效率最高，显著优于商业试剂Jetprime；小鼠肌注后可见荧光信号，20 μg组在48 h荧光强度维持或略有增强。

3.4 G-ICP35 mRNA-LNP制剂的体外稳定表达：Western blot和免疫荧光实验证实，转染后的293T细胞中G和ICP35蛋白共表达，且在18、24、36 h时间点均能检测到。

3.5 G-ICP35 mRNA-LNP制剂在小鼠中诱导强效体液免疫应答：ELISA显示免疫小鼠产生抗RABV IgG抗体，联合组滴度最高达694.5 IU/mL，高于单独mRNA或蛋白组。

3.6 G-ICP35 mRNA制剂在小鼠中诱导抗原特异性T细胞应答：ELISPOT显示免疫组脾细胞经G或ICP35刺激后产生IFN-γ和IL-4，联合组斑点形成细胞数最高；流式细胞术显示联合组CD4⁺/CD8⁺ T细胞比例略高，表明联合免疫有效诱导CD4⁺ T细胞应答。

讨论部分指出，省略UTR的mRNA构建体仍能诱导抗原表达和免疫应答，但该研究未阐明其分子机制，也不能确定ICP35序列是否功能性地替代了UTR。联合免疫的增强效果可能归因于mRNA-LNP的佐剂效应，但由于联合组总抗原剂量更高，无法区分是协同作用还是简单相加效应，需通过剂量匹配的对照实验进一步验证。此外，该研究未直接量化mRNA包封效率，也未采用快速荧光灶抑制试验（RFFIT）或荧光抗体病毒中和试验（FAVN）评估中和抗体，且LNP制备工艺仍需优化以提高可重复性和规模化潜力。结论部分：本研究通过共编码HSV₂ UL26.5基因和RABV G基因，开发了一种省略5′和3′UTR的mRNA制剂，该制剂在体内外均能诱导抗原表达和免疫应答，证明了无UTR构建体的可行性。与亚单位疫苗联合使用时，该制剂诱导的免疫原性高于单独免疫。此外，DC-Chol阳离子脂质体递送系统在体外具有优良的理化特性，转染效率显著高于常规商业试剂，并支持体内蛋白表达，进一步优化有望提升mRNA疫苗的免疫效果。