《Water Biology and Security》：CiTLR1 deficiency impairs intestinal immunity and gut microbiota homeostasis in grass carp after bacterial infection
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在硬骨鱼中，Toll样受体（TLR）广泛表达于黏膜组织，在宿主防御病原微生物中发挥关键作用，尽管TLR1在鱼类肠道免疫中的具体功能仍不清楚。在本研究中，研究人员利用CRISPR/Cas9（成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9）技术生成了TLR1突
在硬骨鱼中，Toll样受体（TLR）广泛表达于黏膜组织，在宿主防御病原微生物中发挥关键作用，尽管TLR1在鱼类肠道免疫中的具体功能仍不清楚。在本研究中，研究人员利用CRISPR/Cas9（成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9）技术生成了TLR1突变体草鱼（Ctenopharyngodon idella），并研究了CiTLR1在维持肠道免疫稳态和微生物群平衡中的作用，特别是在嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）感染后。研究人员成功利用CRISPR/Cas9生成了F0代CiTLR1突变体草鱼（CiTLR1缺陷）。在嗜水气单胞菌感染后，与野生型和阴性对照组相比，CiTLR1缺陷鱼表现出更严重的肠道损伤、杯状细胞丰度降低以及肠道黏膜中免疫球蛋白T（IgT）分布和含量减少。实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）显示，在感染后72小时（hpi），CiTLR1缺陷鱼显著下调了关键免疫基因，包括髓样分化因子88（MyD88）、IκB激酶α（IKKα）、核因子κB亚基1（NF-κB1）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL6）、白细胞介素22（IL22）、黏蛋白2（MUC2）和溶菌酶（Lyz）。16S核糖体RNA（16S rRNA）测序显示，CiTLR1缺陷改变了肠道微生物群多样性，减少了有益菌（Cetobacterium和Barnesiellaceae），富集了机会致病菌（弧菌属Vibrio、假单胞菌属Pseudomonas和Crenobacter），并且嗜水气单胞菌丰度显著增加。这些结果表明，CiTLR1在维持肠道免疫稳态和微生物群平衡中发挥关键作用，其突变损害了宿主对细菌感染的防御能力。
肠道微生物群作为宿主外部的“代谢和免疫器官”，与宿主免疫系统维持双向动态平衡，对健康至关重要。Toll样受体（TLR，一类模式识别受体）通过识别微生物相关分子模式（MAMP）和损伤相关分子模式（DAMP），启动免疫信号通路，在肠道免疫中发挥关键作用。在哺乳动物和鱼类中，TLR2、TLR4、TLR5、TLR9等已被证实参与肠道免疫和微生物群调节，但TLR1在肠道稳态中的具体功能仍不清楚。草鱼（Ctenopharyngodon idella）是全球重要的淡水经济鱼类，集约化养殖使其易受细菌性疾病侵袭，亟需阐明TLR1在肠道免疫和微生物群调节中的功能。研究人员利用CRISPR/Cas9技术成功构建了F0代CiTLR1缺陷草鱼，系统研究了TLR1缺失对肠道免疫和微生物群稳态的影响，揭示了CiTLR1在维持肠道屏障完整性、免疫应答和微生态平衡中的关键作用，为鱼类抗病育种提供了新靶点。该研究发表在《Water Biology and Security》。
主要关键技术方法包括：①利用CRISPR/Cas9技术设计靶向CiTLR1基因第二外显子编码序列（CDS）的gRNA（向导RNA），与Cas9 mRNA共注射入受精卵，构建F0代CiTLR1缺陷草鱼（样本来源：华中农业大学草鱼亲本）；②通过腹腔注射嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）进行感染实验；③采用HE染色和阿尔新蓝染色进行组织病理学分析，评估肠道损伤和杯状细胞丰度；④通过免疫荧光和酶联免疫吸附实验（ELISA）检测肠道黏膜中免疫球蛋白T（IgT）的分布和含量；⑤使用实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测免疫相关基因（MyD88、IKKα、NF-κB1、TNF-α、IL6、IL22、MUC2、Lyz等）的表达；⑥通过16S rRNA基因测序分析肠道微生物群的多样性和组成。
3.1 成功构建CiTLR1缺陷草鱼
研究人员通过测序和qRT-PCR确认，CiTLR1缺陷草鱼（CiTLR1F0）的靶位点序列发生突变，TLR1 mRNA和蛋白表达水平显著低于野生型（WT）和阴性对照（NC）组。感染实验显示，CiTLR1缺陷鱼的存活率显著低于WT和NC组，表明CiTLR1在抗细菌感染中发挥关键作用。
3.2 CiTLR1缺陷加剧嗜水气单胞菌感染后的肠道损伤并减少杯状细胞丰度
HE染色显示，感染后72小时（hpi），CiTLR1缺陷鱼肠上皮脱落和组织水肿较WT和NC组更严重。阿尔新蓝染色表明，CiTLR1缺陷鱼在0 hpi和72 hpi的杯状细胞数量均显著低于对照组。此外，qRT-PCR检测显示，CiTLR1缺陷鱼肠道紧密连接蛋白ZO-1a和occludin a的表达显著降低，提示物理屏障功能受损。
3.3 CiTLR1缺陷降低肠道黏膜中IgT的分布和含量
免疫荧光观察显示，0 hpi时CiTLR1缺陷鱼肠道中IgT分布低于WT和NC组，72 hpi时虽有所增加，但仍低于对照组。qRT-PCR和ELISA结果一致显示，CiTLR1缺陷鱼在72 hpi时肠道IgT mRNA表达和黏膜IgT含量均显著降低，表明IgT介导的黏膜免疫应答受损。
3.4 CiTLR1缺陷降低草鱼肠道免疫基因的表达
qRT-PCR检测发现，CiTLR1缺陷鱼在0 hpi和72 hpi时，MyD88、IL6、IL22、MUC2表达均显著低于WT和NC组；而IKKα、TNF-α、NF-κB1、Lyz在0 hpi时无显著差异，但在72 hpi时显著降低。这表明CiTLR1缺失导致TLR-MyD88-NF-κB信号通路下游免疫基因表达广泛下调。
3.5 CiTLR1缺陷改变肠道微生物群多样性并促进病原菌增殖
16S rRNA测序分析显示，在0 hpi时，CiTLR1缺陷鱼肠道微生物群α多样性（Simpson指数）降低，β多样性显著区别于WT和NC组。有益菌Cetobacterium和Barnesiellaceae丰度降低，机会致病菌Vibrio、Pseudomonas和炎症相关Crenobacter丰度升高。在72 hpi时，上述变化加剧，且嗜水气单胞菌丰度在CiTLR1缺陷鱼中显著高于对照组，表明宿主抗病原菌定植能力下降。
讨论部分总结：CiTLR1缺陷通过损害TLR-MyD88信号通路，导致杯状细胞应激反应减弱、MUC2分泌不足，肠道黏液屏障受损；同时降低MyD88-NF-κB信号活性，抑制IgT+ B细胞活化和抗体产生，进一步削弱免疫防御。微生物群失调（有益菌减少、病原菌富集）与屏障功能障碍形成恶性循环，加剧感染易感性。研究结论翻译：总之，研究人员利用CRISPR/Cas9技术成功构建了CiTLR1F0突变草鱼，突变导致TLR1 mRNA和蛋白表达显著降低。功能分析显示，CiTLR1缺陷加剧了嗜水气单胞菌感染后的肠道病理损伤，减少了杯状细胞丰度，降低了肠道黏膜中IgT的分布和含量。此外，CiTLR1缺陷抑制了肠道关键免疫基因的表达，表明肠道免疫功能广泛受损。重要的是，CiTLR1缺陷显著改变了肠道微生物群的多样性和组成，降低了有益菌丰度，同时增加了致病菌或机会致病菌属的丰度。综上所述，这些发现表明CiTLR1在维持草鱼肠道免疫稳态和微生物群平衡中发挥关键作用。CiTLR1功能受损会破坏肠道黏膜屏障，削弱免疫应答，促进病原菌定植，从而增加细菌感染的风险。
